云南省核桃果实病害调查及真菌病原形态鉴定

2020-12-21张知晓季梅户连荣刘凌

湖北农业科学 2020年20期

张知晓季梅户连荣刘凌

摘要：在云南省10个核桃主产区开展了核桃果实病害调查，对所采集的病果标本进行了切片观察及鉴定。结果表明，在云南省几个核桃主产区中，大理市和楚雄市病害发生较普遍;核桃果实病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病为主;果实病原菌隶属于17属17种，其中，盘长孢状刺盘孢、壳梭孢属之一种、葡萄座腔菌、广布拟盘多毛孢4种真菌出现率最高。

关键词：核桃;果实;病害调查;病原鉴定;云南省

中图分类号：S436.64

文献标识码：A

文章编号：0439-8114（ 2020） 20-0091-05

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.020

核桃（Juglans regia）学名胡桃，是多年生落叶乔木，核桃仁是高档坚果，其种壳能开发成工艺品，木材是制作高档家具的原料，其叶子及果皮可以人药。因其良好经济社会价值，云南省将胡桃作为发展八大产业的重要物种，是打造云南省绿色食品的重要组成部分[1]。近些年来，核桃的种植面积快速增加，有数据显示，截至2017年，云南省核桃种植面积达286.67万hm2，核桃（干果）总产量为115万t，产值318亿元，居全国第一[2]。据报道，中国为害核桃的病害种类多达30余种。在云南省，核桃黑斑病、炭疽病、枝枯病及根腐病等发生普遍，已成为制约全省核桃产业发展和高产稳产的重要瓶颈[3]。

核桃果实病害是影响核桃产量与质量的直接因素，迄今为止，国内对核桃果实病害的研究主要集中在炭疽病和黑斑病等病害的病原鉴定及防治方面[4.5]。而云南省关于核桃果实病害种类、发生状况、分布、危害等全面系统的研究未见报道。鉴于植物病害的症状相似性很高，在一类病害发生时，不是仅出现由单一病原菌引起的单一病害，而是出现由多种病原菌引起的相同或不同病害症状[6]。因此，有必要明确核桃果实病害的发生种类、病原菌及其特点，这是开展病害综合防控的基础。本研究针对云南省10个核桃主产区的核桃果实病害进行较全面地野外调查及真菌病原形态鉴定，以期较全面地了解云南省核桃主产区果实病害发生危害现状及病原菌种类，为云南省核桃病害的防治提供依据，以促进核桃产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

病害标本于2015年5月至2016年8月，以踏查为主分别在云南省核桃主产区的昆明市、昭通市、曲靖市、楚雄市、大理市、保山市、怒江市、临沧市、文山市以及丽江市进行病害调查，采集核桃病果标本并记录病害发生的特点和症状。

1.1.2培养基PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、无菌水1L，用于病原真菌培养及对峙培养。

真菌分离培养基：PDA+青霉素50 |g/mL。

细菌分离培养基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaC15 g、琼脂20 g、无菌水1L，pH 7.2-7.4。

1.2方法

1.2.1 病组织切片及观察对新鲜病害标本病症明显部位进行拍照和描述，制作切片，光学显微镜下观察病原形态;对子实体尚不明显的病果材料进行保湿，待子实体长出后，再做切片观察。

1.2.2 病原菌的分离培养采用组织分离法进行果实病原菌的分离。用75%乙醇溶液对供试材料进行表面消毒，在病健交界处切取一定大小的组织，接人加有抗生素的PDA培养基平板上。每皿接人3块分离材料后将其置于（25±2）℃的恒温培养箱中培养，在新的PDA平板上进行纯化，直至获得纯菌落，4℃保存备用。

1.2.3 病原真菌形态学鉴定

1）病部切片鉴定。于光学显微镜下观察切片上病原菌子实体在植物组织上的着生位置、载孢体、产孢细胞及孢子的形状、颜色等并进行大小计测。孢子大小的测量一般不少于30个孢子，并查阅相关文献，进行种类鉴定。

2）纯菌种培养物的鉴定。采用培养性状和微观形态特征相结合进行鉴定。将分离保藏的纯菌株分别转入PDA平板上，于25℃条件下进行培养，并定期观察记录菌落生长状况（包括菌落形态、颜色、质地及生长和产孢速度等）并拍照。当菌落产孢后，挑取孢子梗、孢子等以无菌水作浮载剂制片，对于腔孢菌类、子囊菌等还需将子实体制作成切片镜检，然后在光学显微镜下观察各菌株的产孢结构、产孢细胞的形态特征、产孢方式及孢子形态、颜色等，同时计测载孢体、产孢细胞、孢子等的大小，最后依据所观测的各菌株宏观和微观形态特征，查阅相关文献确定其归属。

2 结果与分析

2.1 病害调查情况

从云南省核桃主产区采集核桃果实病害标本803份，如图l所示，各地标本采集数量差异较大，标本采集数量的多少在一定程度上可反映核桃不同栽种区果实病害发生的普遍性。采集数量最多的是大理市，达203份，占总采集标本数的25.3%;其次为楚雄市，共采集到185份标本，占总采集标本数的23.0%;标本采集数较少的地区有昆明市（16份）、丽江市（21份）和文山市（4份）。

經调查，云南省核桃果实病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病为主。将所采集的标本进行组织切片和分离纯化，分离的培养物鉴定出的病原真菌与病部切片鉴定相吻合，盘长孢状刺盘孢的出现率最高，为16.33%，其次是壳梭孢属之一种、葡萄座腔菌、广布拟盘多毛孢、胡桃盘二孢、核桃黄单胞菌，出现率分别为10.25%、11.47%、10.83%、9.64%和9.84%。出现率较低的菌株为壳二孢属之一种、成团泛菌2种（表1）。

2.2主要病害的发生危害及病原形态学鉴定

2.2.1 核桃炭疽病

1）症状。如图2A所示，感病果实皮部出现褐色至黑褐色、圆形或近圆形的病斑，中央凹陷，病部有黑色小点产生，有时呈轮状排列，湿度大时可溢出粉红色的分生孢子角。发病严重的果实病斑扩大连片，病部皱缩，全果可发黑腐烂。

2）病原形态特征。如图2B至2D所示，核桃炭疽病病原分生孢子盘散生，直径为122.0-244.0 μm，黑褐色，盘内有较少的暗褐色刚毛。短小的分生孢子梗密生于盘内，无色，产孢方式为内壁芽生瓶体式（ eb-ph），分生孢子圆柱形，长椭圆形，大小为（7.5-17.5）μmx（ 2.5-5.0）μm，单胞，无色。菌落浅褐色，绒状，边缘产黑色小点，为病原菌的分生孢子盘，有时可溢出橘黄色的分生孢子角，后期产子囊壳;菌落背面为黑灰色，有黑色斑点;培养基平板不变色。依据形态确定该病原菌为盘长孢状刺盘孢。

有性态如图3所示，子囊壳球形、近球形、瓶形，大小为（ 80.0-170.0） μmX （60.0-150.0） μm，常聚生。子囊棒状，大小为（37.0-50.0） μmx（7.5-10.0）μm，无柄。子囊孢子椭圆形，大小为（12.5-17.5） μmx（4.0-5.0）μm，单胞，无色。依据形态确定该病原菌有性态为围小丛壳（Glomerella cigulata）。

3）流行病学研究。病原菌以菌丝体、分生孢子盘或子囊壳在病果及病叶上越冬。次年，孢子成熟，并借风雨传播侵染。果实的炭疽在夏季，降雨量较集中时发病较重。栽植密度过大、树冠稠密、通风透光不良的核桃园发病较重。叶部也可受害。

4）分布。云南省昆明市、曲靖市、大理市;其有性态见于曲靖市。

2.2.2 核桃枯果病

1）症状。如图4A所示，感病果实形成较大面积的黄褐色病斑，果皮干枯，不规则开裂。

2）病原。如图4B至图4E所示，子座埋生于寄主表皮下，大小为（ 214.0-590.0）μmX（ 122.0-203.0）μm，内埋生不规则形、半圆形、球形的分生孢子器，大小为[（ 70.0-）120.0-450.0（ -550.0）]μmx[ （40.0-）80.0-190.0（-300.0）] μm;分生孢子梗圆柱形，少有隔，无色，全壁芽生单生式（ hb-sol）产孢。分生孢子顶生，梭形，大小为[（ 2.5-） 5.0-11.0]μmx（ 2.5-4.0）μm，单胞、无色，有时具油滴。依据形态确定该病原菌为壳梭孢属之一种。

3）流行病学研究。病原菌以菌丝体和子座在病残体上越冬。次年春，分生孢子借风雨传播，侵染。主要为害枝条，叶片、果实也可受害。

4）分布。云南省曲靖市、大理市、保山市、临沧市。

2.2.3 核桃果腐病由不同病原菌所引起的果腐都在果实上形成变色的病斑，中部凹陷或不凹陷，大多数果肉已开始腐烂。

1）病原一的症状、病原、流行病学研究及分布如下。

①症状。如图5A所示，感病果实果皮出现紫黑色、近黑色病斑，逐渐扩大并凹陷，其上可见密集的黑色小点，为病原菌的子座和分生孢子器;后期果皮皱裂，内部果肉隆起外露，密生黑色小颗粒，为病原菌有性态的子座和假囊壳。

②病原。如图SB所示，假囊壳聚生，初埋生于子座，后突破子座外露，近球形，有的具喙，假囊壳大小为（100.0-175.0）μmx（ 68.0-150.0） μm。子囊棍棒形，大小为（42.0-57.5）μmx（7.5-12.5）μm，无色;子囊孢子不够成熟。依据形态确定该病原菌为葡萄座腔菌。

无性态：群生小穴壳的分生孢子器球形、近球形，大小为（ 130.0-230.0）μmX（ 100.0-200.0）μm，多个聚于子座。分生孢子梗短，分生孢子梭形、长椭圆形，大小为[ 17.5-25.0（-30.0）] μmX [6.0-7.5 （-8.5）]μm，单胞、无色。依据形态确定该病原菌无性态为群生小穴壳（图5C至图5E）。

③流行病学研究。核桃园内有由该病原菌所致溃疡病（干腐病），故病原菌既可在病果、病落果上，也可在病枝上越冬。次年春，气候适宜时，子囊孢子成熟并传播侵染。分生孢子可作为再侵染源，重复侵染。

④分布。云南省临沧市;其无性态群生小穴壳分布于云南省楚雄市、保山市。

2）病原二的症状、病原、流行病学研究及分布如下。

①症状。如图6A所示，病果出现灰黑色、黑色病斑，且皮部开裂，表生黑色小粒点，为病原菌的分生孢子盘;后期病斑几乎扩大至全果，呈暗褐色，皱缩凹陷，果腐并干枯，出现黑色小粒点，为病原菌的子囊壳。

②病原。如图6B至图6E所示，分生孢子盘初埋生，后突破寄主表皮，直径为126.0-224.0（ -357.0）μm。分生孢子梭形，大小为[15.0-21.5 （-25.0）]μmx [5.0-5.5（ -7.5）]μm，有4个隔膜（隔膜处略缢缩或不缢缩），使其成为5个细胞。其中，两端细胞无色，中间3个细胞同色，均为浅褐色，大小为9.0-15.0μm;孢子顶端具3-5根细长的附属丝，长为5.0-12.5（ -15.0） μm，基部具l根附属丝。菌落绒状，白色，较厚，具环纹或无，后期表面可产黑色颗粒状物，为病原菌的分生孢子盤，可溢出黑色黏液，为病原菌的分生孢子;菌落背面呈浅黄色至浅褐色，具黑色斑点。培养基平板不变色。依据形态确定该病原菌为广布拟盘多毛孢。

有性态：如图7A至图7C所示，子囊壳为瓶形、近球形，大小为（150.0-190.0） μmx（100.0-164.O）μm，浅褐色，具孔口。子囊棒状，大小为（50.0-68.0）μmx7.5 μm，无色，其间有侧丝。子囊孢子椭圆形，有的两端略尖，直或微弯，大小为[ 10.0-12.5（ -15.0）]μmx[4.0-5.0（-7.5）]μm，具2个隔膜，即3胞，浅褐色，隔膜色较深。依据形态确定该病原菌有性态为胡桃多毛壳孢。

③流行病学研究。病菌以菌丝体、分生孢子盘或子囊壳在病株及病残体上存活越冬，于次年春，孢子借风雨传播，从伤口或孔口侵入致病。每年4-9月发病，夏季高温有利于该病害的发生。

④分布。云南省曲靖市、楚雄市、大理市、临沧市;其有性型仅见于大理市和临沧市。

3 小结与讨论

本研究表明，云南省核桃果实病原菌多样性丰富，且各地存在差异。各地核桃病果标本采集数量在一定程度上反映病害发生的普遍性，在云南省几个核桃主产区中，大理市和楚雄市病害发生较普遍，这与不同地区的气候条件、核桃品种、树龄及核桃种植地的立地条件和管护等都有密切关系[7，8]。云南省核桃果实病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病为主。病果共鉴定出病原菌17种，隶属于17个属，其中，仅链格孢属、刺盘孢属[6]、拟盘多毛孢属[9]、泛菌属及黄单胞菌属[10]5个属曾作为核桃果实病害的病原菌被报道。虽然这些病原菌分离鉴定自果实的发病部位，但要确定它们是核桃果实病害的病原菌，还有待通过科赫法则进行进一步的验证。

出现率最高的4种病原真菌为盘长孢状刺盘孢、壳梭孢属之一种、葡萄座腔菌及广布拟盘多毛孢，其中，盘长孢状刺盘孢能够引起核桃果实炭疽病这一结论与王清海等[11]的研究一致，而其他3种也均作为核桃叶部及枝干病原菌被报道[12，13]，表明在叶片及枝干上引起病害的病原真菌，在核桃果实上同样可引起病害。此外，隋韵静[14]还从陕西省核桃果仁水腐病的感病植株分离出一株苍白杆菌（Ochrobactrum pimitosum]，而该菌种在本次调查中并未发现。

由于果实发病后直接使其失去食用和商品价值，且在贮运过程中病果病原菌会迅速传播再侵染，导致更多的健康果实受到侵染，造成大量鲜果腐烂。因此，核桃果实病害需引起重视。有效降低病害发生与危害是一切研究的目标，而病害的准确识别和明确其生物学特性是建立植物病害防治措施的前提和基础。因此，核桃果实病害的识别和分离培养具有重要意义。为有效降低病害的发生，可采取以下措施：第一，因地制宜，选用适应当地条件的核桃抗病品种，合理施肥;第二，加强果园管理，清除病果、病枝和病叶，并集中烧毁或深埋。科学修剪，改善通风透光条件;第三，除了物理防治、农业防治措施外，也可在病害发生的不同时期科学施用安全、高效的化学药剂进行防治。

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