雷公山自然保护区摇蚊科的物种鉴定

余海军 王乙婷 黄鑫 邰春青 郑慧芳 王茜

摘要：基于DNA条形码和形态学对雷公山自然保护区的摇蚊类群进行物种鉴定。结果表明，自然保护区内的摇蚊类群共计4亚科12属18种，并对其中的12属特征进行补充描述，附18种摇蚊成虫的整体标本图;通过DNA条形码分析得到18个mOTU（ Molecular operational taxonomic unit），与形态学结果一致。

关键词：摇蚊科;DNA条形码;物种鉴定;雷公山自然保护区

中图分类号：S931.1

文献标识码：A

文章编号：0439-8114[ 2020） 20-0083-05

D01：10.1408 8/j .cnki.issn043 9- 8114.2020.20.018

雷公山自然保护区（国家级保护区）位于贵州省东南部，地跨雷山、台江、剑河、榕江四县，面积达47 300 hm2。雷公山自然保护区属于长江水系和珠江水系的分水岭地带，是构成清水江和都柳江主要支流的发源地…。自然保护区由于气候温暖，生境复杂，为昆虫物种提供了优良的栖息环境，从而保护区内的昆虫物种资源一直较为丰富。2011年的研究调查显示，雷公山自然保护区昆虫有22目194科1 114属1 861种，其中，双翅目14科89属261种[2]。

摇蚊（ Chironomidae）隶属于双翅目长角亞目（ Diptera：Nematocera），全世界已记述的种类超过6 359种[3]。摇蚊广布于各种水体中，是种类最多、分布最广的淡水底栖动物类群之一[4];由于摇蚊的迁移能力相对较弱，不同种属之间的生态要求和生活习性多种多样，不同类群对生存环境适应变化有较大的差异，从而使得它们成为水环境生物监测的优良指示物。

截至2001年，国内有关摇蚊研究的论文达200余篇[5]。DNA条形码问世后[6]，学者将其结合传统形态学广泛用于摇蚊的研究，取得了较大的成果，特别是在江浙一带，关于摇蚊研究的报道层出不穷[7-13]。雷公山自然保护区的地质结构复杂，岩石层中富含独特的化学物质和生命营养物质，是生命科学和地球科学之间微观联系的地区[2]。李小海等[14]2014年在雷公山自然保护区发现昆虫3种新纪录种，即鳞翅目1种，鞘翅目2种;付梓源等[15]2015年通过对雷公山自然保护区进行生物调查，记述昆虫15种，即半翅目1种，鳞翅目4种，鞘翅目10种;但迄今为止，该地区关于双翅目的报道，尤其是摇蚊物种的报道较为鲜见。本研究通过DNA条形码和形态学对自然保护区内的摇蚊进行研究，目的是为中国DNA条形码数据库提供有效数据，以及提供基础数据用于今后雷公山自然保护区的生态环境研究和生物多样性评估。

1 材料与方法

1.1 标本制作及鉴定

所用标本均来自于2019年8月21日至10月7日贵州省黔东南州雷山县雷公山自然保护区。样本保存于85%乙醇，标本照片采用智能数字立体解剖镜进行整体照。并在体视镜下解剖为头、胸、足、翅、腹部5个部分，头、胸部留取用作DNA提取，其余部分用Eurpal树胶封片，DNA提取后头、胸部相继封存于相应的玻片上作为证据标本。形态鉴定特征术语采用文献[16]的描述方法，特征的测量参考李丽梅[17]的研究方法;证据标本均保存于天津农学院水产遗传育种实验室。

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

基因组DNA提取采用Qiagen DNA Blood andTissue kit试剂盒，并按照试剂盒说明书提取。使用通用引物LC01490和HC02198[18]扩增COI条形码。PCR扩增反应体系为25.000 μL.包含12.500 μL 2xEs Taq MasterMix（ CoWin Biotech Co， Beijing， China），上、下游引物各0.625 μL，无菌水8.750 μL，DNA模板2.500 μL。通过Mastercycler Gradient进行扩增，扩增程序为：预变性98℃10 s，94℃5 min;94℃1 min，51℃1 rriin.72℃1 min，35个循环;最后延伸72℃5 min;10℃保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行纯化测序。

1.3 数据处理

根据测序公司返回的序列导人Seqman（ DNA-STAR，Madison，USA）中进行编辑[7]。序列通过MEGA 7.0软件使用MUSCLE算法进行比对，并对序列特征及各碱基含量进行统计;使用Kimura-2-parameter （K2P）碱基替换模型计算各序列之间的遗传距离;选用K2P碱基进化模型，节点处置信度为1 000，其他设置均为默认值，建立NJ （Neighbor-joining）树。

2 结果与分析

2.1 DNA条形码分析结果

采用DNA条形码分析中最常用的NJ法，该法基于遗传距离和最小进化原理，通过自举检验法进行聚类，并通过统计给定树分支的可信度，得出最优树[19]。在NJ树中，基于27条DNA条形码明显分离出18个mOTU，代表摇蚊科中已命名的物种，该结果显示DNA条形码的鉴别结果与形态学鉴定结果一致，如图1所示。同时，研究所用的27条DNA序列及其相关信息均已上传Barcode of Life Data System（ BOID，http：//www. boldsystems.org）数据库的公开Project“HJB”。

2.2保护区摇蚊种类记述

本研究记述雷公山自然保护区摇蚊物种共4亚科12属18种，基于Wiederholm[20]对摇蚊科物种形态学的描述，对其中12属的主要特征进行补充描述，并提供18种的标本整体照。

2.2.1 摇蚊亚科（Chironominae） Macquart

1）摇蚊属（Chironomus Meigen）。主要特征：体型中到大型。体色绿或淡棕黄色，触角11节，触角比（AR）远大于2.0;翅膜质部分没有刚毛，有明显刻点，花翅摇蚊（Chironomus kiiensis）翅上有明显的翅斑，臀角具刚毛，R、R1、R4+5有刚毛，腋瓣具有缘毛。中后足胫节具有排列紧密的胫栉，有强壮的胫距，伪胫距存在或者缺失。腹部背板有分散或密集的刚毛。肛尖端部膨大;上附器细长，末端钩状;下附器棒状，末端靠近抱器端节中部。

世界广布，中国记录24种，本研究记述2种，分别为黄羽摇蚊（Chironomusflaviplumus）（图2A）、花翅摇蚊（图2B）。

2）多足摇蚊属（Polypedilum Kieffer）。主要特征：体小型到大型。体色淡黄、棕黄或黑色，翅具翅斑或呈褐色，足有时具各种黑色环。触角鞭节13节，触角比0.60-3.50;R、R1、R4+5有刚毛。肛尖细长。上附器细长多变，基部具长毛和微毛;中附器缺失;下附器棒状，抱器端节形状和长度多变，与抱器基节相连处窄。

世界广布，中国记录62种，本研究记述6种，分别为源平多足摇蚊（Polypedilum genpeiense）（图2C）、浅川多足摇蚊（Polypedilum asakawaense（图2D）、加茂三多足摇蚊（Polypedilum kamotertium）（图2E）、阳山多足摇蚊（Polypedilum yougsanensis）（图2F）、仙居多足摇蚊（Polypedilum xianjuensis）（图2G）、刀铗多足摇蚊（Polypedilum cultellatum）（图2H）。

3）拟摇蚊属（Parachironomus Lenz）。主要特征：体中到大型，翅长2.00-4.50 mm;体黄或棕色，色斑棕色或黑色，部分种类足和腹部具色带。触角11节，触角比1.50-3.30。翅膜区无毛，少数具顶刚毛，腋瓣具较多缘毛。生殖节第九背板后缘形态多变，锲形，圆形，或明显形成侧翼。肛尖细长;上附器长短不一，顶端常具喙状侧突，端部具刚毛，生于凹陷处;下附器叶状突起有时退化。抱器端节与基节愈合，形状多样。

世界广布，中国记录13种，本研究记述1种，为细突拟摇蚊（Parachironomus exilisus）（图21）。

4）明摇蚊属（Phaenopsectra Kieffer）。主要特征：体中到大型，翅长2.08-3.00 mm;体棕色;足浅黄色;触角13节，触角比1.00-3.00;翅膜区具斑点和少量刚毛，腋瓣具短缘毛;生殖节第IX背板中部具刚毛;肛尖细长，端部略膨大;上附器细长，端部钩状，基部具刚毛;下附器指状或棒状，常密布刚毛，端部常具长刚毛;无中附器;抱器端节细长，形态多变，常呈棒状。

本研究记述1种，为黄明摇蚊（Phaenopsectraflavipes）（图2J）。

5）萨博摇蚊属（Sublettea Roback）。主要特征：体小型，翅长1.07 mm;体黄色，足浅黄色;触角13节，触角比0.36;生殖节肛尖无刺状突起，中附器叶状，上附器端部收缩，指附器长且弯曲。

本研究记述1种，为威尔萨博摇蚊（Subletteawilesi）（图2K）。

6）长跗摇蚊属（Tanytarsus van der Wulp）。主要特征：触角13节，触角比0.17 -2.20。部分种类腹部具色带。翅膜区密被刚毛;R1翅室末端部分、R4+5脉和M1+2脉具刚毛，Cu脉无刚毛。生殖节第九背板带中部分离，愈合成Y形或末端于肛尖基部愈合;肛尖有或无肛脊，肛脊之间常具小棘刺;上附器形状多样，下附器直或细而弯曲;中附器存在，呈叶状。

世界广布，中国记录约40种，本研究记述1种，为台湾长跗摇蚊（Tanytarsus formosanus）（图2L）。

7）夏摇蚊属（Xiaomyia Sc-ether&Wang）。主要特征：体小型，翅长1.17-1.44 mm;体黄，腹部具蓝色带。触角13节，触角比0.81-0.83。所有足均具单胫距，无胫栉。生殖节抱器端节具齿，并可以转动，抱器基节与下附器愈合。

中国记录1种，本研究记述1种，为似足夏摇蚊（Xiaomyia aequipedes）（图2M）。

2.2.2寡角摇蚊亚科（Diamesinae） 波摇蚊属（Pot-thastia Kieffer）。主要特征：体中型，触角13节，体棕黄，足浅黄色并具少量色斑，触角比1.50-2.50。翅表面缺少刚毛，斑点色浅;前缘脉稍伸长，R2+3脉明显，R4+5脉无刚毛。生殖节肛尖小，上有或无刚毛;抱器端节上存在较长的抱器端棘。

中国记录3种，本研究记述1种，为双角波摇蚊（Potthastia montium）（图20）。

2.2.3 直突摇蚊亚科（Orthocladiinae）

1）环足摇蚊属（Cricotopus van der Wulp）。主要特征：体型不等，小型至大型，翅长4.00 mni。足和背板通常有色斑间隔及明亮颜色的色环。触角13节，触角比0.30-2.10。翅膜区无刚毛，腋瓣具缘毛。足具色环，中足、后足极少具l根胫距，伪胫距缺失。生殖节肛尖常缺失;如果存在非常小，背板侧毛退化;上附器扁平、圆状或驼峰状;下附器形态多样，叶状或被腹叶成对;抱器端节簡化，亚端背脊窄并在顶端具刚毛，抱器端棘存在或缺失。

世界广布，中国记录18种，本研究记述1种，为三束环足摇蚊（Cricotopus trifascia）（图2P]。

2）中足摇蚊属（Metriocnemus van der Wulp）。主要特征：体小到中型，翅长1.50-1.83 mm。体淡黄色或棕黑。触角13节，触角比0.80-1.50。翅膜区通常密具刚毛或具有细小至粗糙的刻点，臀角中部十分发达，R脉有毛，腋瓣具缘毛。生殖节肛尖细长，由基部到顶端逐渐变细尖，第九背板有或者没有毛，抱器基节具有发达或明显退化的下附器，有的为瓣状下附器;抱器端节细长，具有小、尖三角形亚端背棘，或者亚端背棘不发达。

中國记录6种，本研究记述1种，为一线中足摇蚊（Metriocnemus unilinearis）（图2Q）。

2.2.4 长足摇蚊亚科（Tanypodinae）

1）无突摇蚊属（Ablabesmyia Johannsen）。主要特征：体小到中型，翅长1.38-4.00 mm。体棕黄色，足具色带。触角13节，触角比1.25-3.60。有些种类翅膜区有刚毛，翅上有明显的翅斑。抱器基节基部轻微膨大，并向端部逐渐变窄，有明显的背部刚毛和内侧的刚毛簇;抱器端棘耳状，末端变宽或有亚端部刚毛存在;上附器直或微弯曲，末端圆或尖;中附器多数比上附器短;下附器退化成一个小突起。

中国记录16种，本研究记述1种，为前桅无突摇蚊（Ablabesmyia prorasha）（图2R）。

2）前突摇蚊属（Procladius Skuse）。主要特征：体小到中型，翅长1.30-4.20 mm。体棕或黑色，腹部有明显的色斑带。触角13节，触角比1.34-2.90。翅膜区有或无被毛，偶具翅斑;前缘脉超过R4+5脉很多，到达翅的顶端;MCu脉位于FCu脉前端;R2+3脉存在，并分叉，腋瓣具缘毛，臀角发达。生殖节肛尖宽，端部圆钝;抱器基节基部宽，端部1/2处逐渐变窄;下附器多毛，明显或不明显或缺失;抱器端节粗壮或细长;抱器端棘短且粗。

中国记录9种，本研究记述1种，为黑前突摇蚊（Procladius nigriventris）（图2S）。

3 小结

本研究采集中国贵州省黔东南州雷山县雷公山自然保护区的摇蚊昆虫4亚科12属18种，共计27个样本。基于形态学对12属的特征进行补充描述，并提供18种摇蚊成虫的整体标本;在此基础上使用DNA条形码技术对27个样本进行分子鉴定，NJ树的结果显示，数据集分离出18个mOTU，与传统形态学鉴定一致，为进一步证明DNA条形码能准确鉴别摇蚊科昆虫提供数据支持。本研究的数据均已上传中国DNA条形码数据库，在丰富中国摇蚊科数据库的同时，也为雷公山自然保护区的生态环境研究和生物多样性评估提供基础数据。

参考文献：

[1]周正贤，姚茂森，雷公山自然保护区科学考察集[M]贵阳：贵州人民出版社，1989

[2]李兴春，王斌，梁芬，等.贵州雷公山自然保护区昆虫资源多样性调查初报[J].吉林农业，2011（4）：276-277.

[3]宋超.基于形态和分子数据的摇蚊亚科高级阶元系统发育研究（双翅目：摇蚊科）[D]天津：南开大学，2019.

[4] ARMITACE P D.CRANSTON P S，PINDER L C V.The Chironomi-dae： Biology and ecology of non-hiting midges[M].Springer sci-ence. Business media dordrecht. 1995.572.

[5] WANG X H.Nuisance chironomid midge recorded from China（ Dip-tera） [A]. HOFFRICHTER O.Late 20lh century research on Chi-ronomidae. An anthology from l3th internalional symposium on Chi-ronomidae[M].Shaker Verlag， Aachen， 2000.653-658.

[6] HEBERT P D N.CYWINSKA A.BALL S L.et al. Biological identi-fications chrough DNA barcodes IJ]. Proceedings of Lhe royal societyB： Biological sciences， 2003 ，270（ 1512）： 313-321.

[7] LIN X L，STUR E，EKREM T.Exploring genetic divergence in aspecies-rich insect genus using 2790 DNA barcodes IJl.PLos one，2015. 10（9）：1-24

[8] SONG C， WANG Q.ZHANGR L，et al.Exploring Lhe utility of DNAbarcoding in species delimitation of PobpediLum（ Tripodura） non-biting midges（ Diptera： Chironomidae）[J] .Zootaxa， 2016.4079（5）：534-550.

[9] SONG C， LIU W B.ZHANG R L，et al Two gynandromorphic spe-cies of Polypedilum Kieffer. 1912 （Diptera： Chironomirlae）， with DNA barcodes from OrienLal China IJl.Pan-Pacific encomologisc，2017.93（2）：95-104.

[10] SONG C.LIN X L.WANC Q，et al.DNA barcodes successfully de-limit morphospecies in a superdiverse insect genus [J].Zoologicascripta.2018.47（3）：1-14.

[11] QI X， WANC X H. ANDERSEN T， et al.A new species of ManoaFittkau（ Diptera： Chironomidae）， with DNA barcodes from XianjuNacional Park， Oriental ChinaEJl.200taxa.2017.4231（3）：398-408

[12] QI X. LIN X L，EKREM T， et al.A new surface gliding species ofChironomidae： An independent invasion of marine environmentsand its evolutionary implications[J].Zoologica scripta.2018 .48（1）：81-92

[13] LIN X L，YU H J，ZHANG R L，et al PoLypedilum r Cerobregma）heberti sp.IL（Diptera： Chironomidae） from Caoligong Mountains，Yunnan， China[J l.Zootaxa. 2019 .4571（2）：255-262.

[14]李小海，謝镇国，余永富，等雷公山自然保护区生物物种新纪录[J].农技服务，2014.31（6）：224-227.

[15]付梓源，谢镇国，余德会，等雷公山保护区生物物种多样性新纪录[J].吉林农业，2015（ 12）：105-106.

[16] SAiTHER O A Clossarv of chironomid morphology terminology（ Diptera： Chironomidae）[J].Ent Scand Suppl， 1980. 14： 1-51.

[17]李丽梅中国南部翅扇类微型直突摇蚊（双翅目：摇蚊科）分子鉴定[D].广州：暨南大学，2014.

[18] FOLMER O.BLACK M.HOEHW，et al DNA primers for amplifi-cation of mitochondrial cvtochrome coxidase subunil l from di-verse metazoan invertebrates[J] .Molecular marine biology and bio-technology， 1994.3（5）：294-299.

[19] DUARTE S， BATISTA D， BARLOCHER F，et al.Some new DNAbarcodes of aquatic hyphomyceLe species [J]. Mycoscience， 2015，56（1）：102-108.

[20] WIEDERHOLM T. Chironomidae of the Holarctic region， Part 3：Adult males keys and diagnoses[M l.Sweden： Entomological soci-

ety oflund. 1989

作者简介：余海军（1994-），男，贵州雷山人，在读硕士研究生，主要从事分子系统学研究，（电话）18322040463（电子信箱）yhjl8322040463@163.com;通信作者，王茜（1971-），（电话）13682014584（电子信箱）wqgt1999@163.com。