西藏濒危植物大花黄牡丹内生真菌及其根际土壤真菌的群落多样性研究

禄亚洲， 张二豪， 尹 秀， 蔡 皓， 袁 雷， 李连强， 赵垦田， 兰小中

(1. 西藏农牧学院 高原生态研究所， 林芝 860000； 2. 西藏农牧学院 西南大学药用植物联合研发中心， 林芝 860000； 3. 西藏农牧学院 食品科学学院， 林芝 860000； 4. 西藏农牧学院 资源与环境学院， 林芝 860000)

内生菌普遍存在于各种陆生及水生植物中[1]。人们发现植物体内存在大量有益的内生细菌和内生真菌，这些内生菌在植物体内能行使多种生物学功能，为植物提供生长所需的营养物质如氮源(内生共生固氮)以及一些激素，能够促进植物快速生长，增强植物抗逆境、抗病害及抗动物危害的能力[2]。

毛茛科芍药属的大花黄牡丹[Paeonialudlowii(Stern & G.Taylor) D.Y.Hong]为西藏特有濒危植物，其花大且色艳，拥有芍药属其他植物少有的黄色花基因[3]，根中含有丹皮酚，具有重要的药用价值。根皮的挥发油及其主要成分丹皮酚可以显著抑制人肺癌 A549 细胞的增殖，诱导 A549 细胞的凋亡，对断发毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏样小孢子菌3种皮肤癣菌均有抑制作用，且根皮挥发油的抑菌作用略高于丹皮酚[4]。大花黄牡丹生存条件极为苛刻[3]，为丛生灌木[5]，属国家二级濒危植物，喜温和气候，较耐寒，抗旱能力较弱，分布在西藏林芝市巴宜区至米林县长约100 km的开阔河谷地带，垂直分布范围为海拔2 500～3 500 m[6]。目前，有关大花黄牡丹的研究主要集中在分类学[7]、生态学[8]、栽培学[6]、孢粉学[9]、病理学[10]、生理学[11]和形态学[12]等方面，而其内生菌方面的研究鲜有报道[13]。本研究利用高通量测序分析法，研究西藏林芝县米瑞乡大花黄牡丹植株不同组织器官及其根际土壤中真菌群落结构和大花黄牡丹内生真菌及其根际土壤中真菌群体的多样性特征，以期为揭示大花黄牡丹植物内生真菌多样性特征及其内生真菌的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及消毒

大花黄牡丹植物组织及根际土壤均采集于西藏林芝市林芝县米瑞乡(29°32′43.96″N，94°38′33.03″E)，大花黄牡丹果期采集样本(2018年6月5日)，植物不同组织样品(根、茎、叶、花和果实)均随机采取10株植物组织并混匀，每组3个重复，将采集的样品置于无菌袋中低温保存带回实验室，12 h内处理。将带回实验室的大花黄牡丹植物组织样品先用无菌水冲洗6次，直至样品清洗干净，然后用75%体积分数的酒精消毒30 s，再用10%质量分数的NaClO消毒5 min，无菌水反复洗涤3次，消毒处理后的样品-80 ℃保存。为了检测消毒效果，取消毒处理后最后一次冲洗的无菌水涂布于胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA固体培养基)上，观察是否有菌落生成。随机采集10株大花黄牡丹不同深度根际土壤(上层0～10 cm，中层10～20 cm，下层20～30 cm)样品，同层随机混合并装入无菌袋中，每组3个重复，低温保存带回实验室，随后利用2 mm孔径筛子进行筛土，以除去毛根等植物残体，装入无菌袋中-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取

根据参考文献[14]的方法，使用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Germantown, MD, USA)提取植物组织及新鲜土壤样品DNA，然后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA提取质量，并用紫外分光光度计检测DNA的浓度。

1.2.2 PCR扩增

利用ITS1-F和ITS4-R引物对真菌rDNA的ITS区域进行PCR扩增[15]，引物由武汉华大公司合成。PCR扩增采用20 μL反应体系：10×PCR Buffer 2 μL，5 mmol/L dNTPs 1 μL，5 μmol/L IST1-F引物1 μL，5 μmol/L IST4-R引物1 μL，rTaqPolymerase 0.2 μL，Template DNA 1 μL，补ddH2O至20 μL。PCR扩增条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并纯化PCR产物，将纯化后的PCR产物送至武汉华大测序，Illumina测序结果上传至NCBI，排除171条低相似度的OTUs序列，其余625条OTUs序列获得注册号MK983532-MK984156。

1.2.3 数据分析与处理

测序所得的原始数据经数据过滤排除干扰数据，将获得的高质量数据拼接成Tags。利用UPARSE在97%相似度将Tags序列进行OTU聚类，然后通过OTU与NCBI数据库比对，对OTU进行物种注释[16]。利用QIIME 软件对单个样品进行Alpha多样性分析，包括Sobs(richness)、Simpsoneven、Shannon指数以及Simpson指数等[17]。Sobs(richness)值越大，说明样品中的物种越丰富，Simpsoneven值越大，说明样品中物种均匀度越高， Shannon指数和Simpson指数反映物种群落多样性。利用QIIME(v1.80)软件进行物种进化分析和Beta多样性分析，用Bray-Curtis、weighted UniFrac、unweighted UniFrac指数来衡量Beta多样性[17]。

2 结果与分析

2.1 大花黄牡丹植物组织内生真菌及根际土壤真菌序列和多样性分析

采用真菌rDNA高通量测序技术对大花黄牡丹组织内生真菌及根际土壤真菌多样性进行分析。结果表明，大花黄牡丹根、茎、叶、花和果实中有效的内生真菌序列分别为15 182、15 291、15 257、15 244和15 265，所形成的OTU数分别为228、55、70、110和69(表1)。结果表明根部OTU个数最多，而茎中的OTU个数最少。不同深度根际土壤的有效真菌序列分别为14 891、14 994和15 042，OTUs个数分别为421、319和258。结果表明有效的根际土壤真菌序列数随土壤深度的增加而逐渐增加，但形成的OTUs个数逐渐减少。Alpha多样性分析表明，而果实中物种均匀度最高，根际上层土壤中真菌丰富度、均匀度和多样性高于中层和下层土壤(表1)。

表1大花黄牡丹植物组织内生真菌及根际土壤真菌群落组成和多样性

(a)大花黄牡丹不同组织内生真菌及土壤真菌稀释曲线；(b)不同植物组织内生真菌韦恩图；(c)不同深度根际土壤真菌韦恩图

稀释曲线分析结果表明所测样品足以覆盖所有类群。如图1(a)所示，随着测序深度的增加，所有样品曲线趋于平缓。韦恩图分析结果表明大花黄牡丹不同植物组织中共有5个相同的OTUs，根部特有内生真菌OTUs个数最多，198个，花中次之，57个[(图1(b)]。而不同深度的根际土壤共有135个OTUs，根际土壤特有OTUs个数随着土壤深度的增加而逐渐减少，分别为185、62和48个OTUs[图1(c)]。

2.2 大花黄牡丹不同植物组织及土壤样品中真菌群落结构组成

2.2.1 在门、纲水平上大花黄牡丹不同样品中真菌群落组成

对获得的大花黄牡丹不同组织内生真菌及根际土壤真菌的796个OTUs进行注释分类，结果表明不同植物组织中76 239个序列隶属于6门13纲(图2)。子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)是优势菌门，相对丰度分别为63.80%～85.30%和10.40%～36.20%。果实、花、叶中仅有2个门，即子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)；茎中有3个门，分别为子囊菌门(Ascomycota，72.20%)、担子菌门(Basidiomycota，27.00%)和被孢霉门(Mortierellomycota，0.70%)；根中有6个门，其中3个门的相对丰度≥1%，分别为子囊菌门(Ascomycota，84.50%)、担子菌门(Basidiomycota，10.40%)和被孢霉门(Mortierellomycota，2.40%)[图2(a)]。在纲水平上隶属13纲，其相对丰度≥1%，有10个纲。根部分布的纲最多，隶属9纲，其次是茎和叶，隶属7纲；花和果实最少，隶属6纲。圆盘菌纲(Orbiliomycetes)、盘菌纲(Pezizomycetes)和Rozellomycotina是根部特有纲，而伞菌纲(Agaricomycetes)是果实、花、茎和叶特有纲[图2(b)]。

(a)门水平真菌群落组成;(b)纲水平真菌群落组成

不同深度根际土壤真菌中44 927个序列隶属于7门11纲。子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)是优势菌门，相对丰度分别为38.38%～55.70%和22.3%～38.77%；其次是被孢霉门(Mortierellomycota)，相对丰度分别为14.24%～19.76%。在纲水平上隶属13纲，其相对丰度≥1%有6纲，分别为Agaricomycetes、Dothideomycetes、Leotiomycetes、Mortierellomycetes、Sordariomycetes 和Tremellomycetes。回盘菌纲(Orbiliomycetes)是上层土壤特有纲，其相对丰度为0.01%。

2.2.2 不同大花黄牡丹样品中真菌群落在科、属水平上的组成

物种热图(图3和图4)分析表明，大花黄牡丹不同组织内生真菌被聚类为49科，每科在不同组织中的相对丰度存在显著差异。在相对丰度≥1%条件下，果实中内生真菌有15个科，其中:Cladosporiaceae、Filobasidiaceae和Mrakiaceae是优势科，其相对丰度分别为24.46%、16.00%和10.45%；根部有10个科，Herpotrichiellaceae和Helotiales是优势科，相对丰度分别为22.26%和15.56%；花中13个科，茎中11个科，叶中9个科，花、茎、叶中的优势科均为Cladosporiaceae，其相对丰度分别为36.66%、34.62%和63.09%。大花黄牡丹内生真菌在属水平上隶属于67个属，属水平物种丰度热图分析结果表明，不同组织样品中物种丰度均不相同，根中的优势属是Leptodontidium(13.11%)，茎、叶、花及果实中的优势属是Rachicladosporium，其相对丰度分别为28.53%、59.45%、19.77%和12.35%(图4)。

聚类表示所有物种在不同样品间表达的相似情况，热图颜色由红到绿表示物种相对丰度从低到高；下同

不同深度根际土壤真菌群落组成和分布相似，上、中、下层根际土壤的优势科是Nectriaceae(16.06%～30.89%)，Hygrophoraceae(15.45%～23.05%)、Mortierellaceae(14.24%～19.74%)；其优势属是湿伞属(Hygrocybe)和被孢霉属(Mortierella)，其相对丰度分别为14.44%～22.48%和14.24%～19.74%(图3和图4)。无论在科水平上还是在属水平上，物种聚类热图结果表明根部内生真菌与根际土壤真菌群落组成存在相似性，均被聚类为1组，共有29科32属(图3和图4)。

2.3 大花黄牡丹不同样品间真菌多样性比较分析

为了分析大花黄牡丹不同样品间真菌多样性差异，本研究通过Beta多样性的PCoA (principal coordinate analysis)和 CLC(complete linkage clustering)的分析来阐明不同样品间多样性差异。如图5(a)所示，所有样品被聚类为两个类群(类群1和2)，类群1包括茎、叶、花和果实，类群2包括所有不同深度根际土壤样品和根，结果表明不同样品间差异较大，PC1值为32.26%，PC2值为18.66%。CLC分析结果与PCoA分析结果[图5(b)]相似，所有样品聚类成两个类群，类群1(Group 1)包括果实、花、茎和叶，类群2(Group 2)包括不同深度根际土壤样品和根。

图4 属水平上物种热图Figure 4 The analysis of heatmap at the genus level across all sample types

A：基于真菌OTUs相对分度的PCoA分析，T代表植物组织，S代表土壤；B：基于加权UniFrac 的CLC分析

2.4 Biomarker 分析

为了进一步鉴定不同样品间的显著性差异和主要贡献的生物类群，本实验采用微生物组间差异分析(Linear discriminant analysis effect size, LEfSe)[18]检验不同样品间的显著贡献关系。结果表明，根际土壤样品与植物组织间具有差异显著的生物标记。在纲水平上，座囊菌纲(Dothideomycetes)是植物组织中的标志类群，根际土壤中的标志类群是子囊菌纲 (Sordariomycetes)和伞菌纲(Agaricomycetes)；在科水平上，植物组织中的标志类群是Mycosphaerellaceae和Cladosporiaceae，土壤中的标志性类群是Nectriaceae(图6)。

以进化分支图(cladogram)表示，T代表植物组织，S代表土壤

3 结论

大花黄牡丹不同组织内生真菌群落丰富度和多样性不同，而不同深度土壤中的真菌具有相似的丰富度与多样性。在植物组织中，根部内生真菌物种的丰富度和多样性最高，植物组织内生真菌与根际土壤真菌存在不同程度上重叠，且根部内生真菌与根际土壤真菌群落组成最为相似，说明根部内生真菌部分可能来自根际土壤。座囊菌纲和子囊菌纲作为大花黄牡丹组织和根际土壤的标志类群，且座囊菌纲和子囊菌纲具有一定重要的药用价值，因此内生真菌与大花黄牡丹的药用功能可能存在一定的关联性。因此研究大花黄牡丹内生真菌及根际真菌群落之间的内在联系，对大花黄牡丹药用价值和促进其种子萌发真菌的进一步研究具有重要意义。