HPV致宫颈癌机制研究进展

丁 璐 综述， 程忠平 审校

(同济大学附属第十人民医院妇产科，上海 200072)

近年来，研究表明HPV与宫颈癌发病相关，目前已分离出200多种HPV病毒，并且根据其致病力及致癌作用将其分为高危型HPV和低危型HPV，其中部分HPV可以通过性接触传播[1]，HPV病毒具有嗜上皮特性，其感染宿主后可在表皮、生殖器、口腔黏膜等部位的上皮基底细胞中大量复制，当机体免疫力降低后可随机整合到宿主基因组中，随后沉默E2基因，从而减少其对E6、E7基因的抑制，使E6、E7蛋白过表达，辅以E5蛋白的表达，从而诱导感染细胞无限增殖甚至癌变。研究表明高危型HPV的持续感染与高级别子宫颈病变(high-grade intraepithelial lesion, HSIL)[2-3]及宫颈癌的发生密切相关[4]。研究发现，90%的宫颈癌与高危型HPV持续感染密切相关，其中HPV16、18型的相关度最高。宫颈癌在全球女性恶性肿瘤发病率中排名第4，在15～44岁女性恶性肿瘤发病率中高达第二[1,5-6]，是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，每年全球约有530000例的初诊宫颈癌病例，其中约有130000例是中国人[7]。因此，研究HPV的结构及致瘤机制，对减少我国宫颈癌的发病率及降低死亡率尤为重要。

1 HPV结构

HPV是无包膜的具有嗜上皮性的双链环状DNA病毒(长度约8000bp)，病毒由核酸和衣壳蛋白组成，其中核酸为闭合环状DNA基因组，可分为以下3个基因组区域[约10个开放阅读框(open reading frame, ORF)]：早期编码区(E区)——编码非结构蛋白；晚期编码区(L区)——编码病毒粒子和病毒传播所需的结构蛋白[8]，长调控区(long control region, LCR)——含有早期启动子、调控病毒和细胞蛋白转录的调控位点[9]。

1.1 早期编码区(E区)

E区含E1、E2、E4、E5、E6、E7这6个早期基因，约占基因组的50%。E1、E2基因编码E1、E2蛋白，调节病毒DNA的复制和转录，且E2蛋白在机体感染HPV病毒后可以维持胞内转运及感染细胞内的DNA复制，此外合成的E2蛋白还可以抑制E6和E7基因的转录[10]。E4基因可以编码产生E4蛋白，可以促进病毒的复制，并可以破坏细胞骨架，促进病毒粒子从受感染的上皮细胞内逸出，向周围组织扩散[11]。而E6、E7基因编码产生的E6、E7蛋白作为主要的致癌蛋白，参与了细胞癌变的过程。E6蛋白主要与p53蛋白结合从而使p53失活，促进p53降解，诱使感染细胞维持在细胞周期S期；而E7蛋白则与视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, pRB)结合，使pRB失活，从而失去其对细胞周期的调控作用，诱导感染细胞向癌变方向发展[12]。E5蛋白可以与多种宿主细胞蛋白相互作用，最近有研究表明E5蛋白作为癌蛋白，可以刺激细胞增殖，抑制死亡受体诱导的细胞凋亡，以及调控与细胞黏附和免疫功能有关的基因复制和转录[13]。

1.2 晚期编码区(L区)

L区有L1、L2 2个晚期基因，约占基因组40%，分别编码L1、L2蛋白。HPV的衣壳蛋白由主要蛋白L1和次要蛋白L2组成。电镜三维结构显示，HPV病毒是由72个五聚体构成的T=7的正20面体，在该结构中L2蛋白与L1蛋白以1∶5～1∶10的比列分布，每个五聚体由5个L1蛋白单体聚合而成，而L2蛋白则包埋于每个五聚体的中心区域[14]。L1蛋白可以自组装成病毒样颗粒(virus-like particle, VLPs)，可作为一种特异性免疫抗原，具有较高的免疫原性，可以诱发机体产生高低度的中和抗体和细胞免疫的表位，从而使细胞免受HPV病毒的再次攻击[15]。L2蛋白包埋与每个五聚体的核心区域，只留N-末端残基于五聚体表面，从而在细胞吸附和细胞复制过程中发挥作用，除此以外，L2蛋白还可在内吞入胞、入核、囊泡转运等过程中发挥一定作用[16]。

1.3 长控制区(LCR区)

位于L1基因和E6基因间的非编码区，约占整个病毒基因组的10%，可分为3个区段：5′区段、中心区段、3′区段。5′区段囊括第1个E2蛋白结合位点(E2bs)、转录终止和多腺苷酸化的结合位点。中心区段的两端各有1个E2蛋白结合位点，中间是一些刺激或抑制病毒转录活动的基因序列，这些序列包括与AP1、NF1、TEF1、OCT1、YY1、BRN-3a、NF-IL6、KRF-1、NF-κB、FOXA1和GATA3等的结合位点。3’区段则有2个E2蛋白结合位点和一个E1蛋白结合位点(E1bs)，重叠在复制起源处。LCR区含有病毒转录、细胞蛋白翻译的多个调控位点，从而调控早、晚期编码区的基因转录和病毒颗粒的合成。

2 HPV致宫颈癌机制

HPV可以通过微小的皮肤损伤进入到上皮基底细胞中，在这些上皮基底细胞中只检测到HPV DNA，没有检测到病毒衣壳蛋白，这表明在某些条件下HPV DNA可以目前尚未明确的机制随机整合到宿主细胞基因组中，随后干扰E2基因的表达，从而削减E2基因对E6、E7基因的负性调节作用，进一步抑制p53和pRB，促使感染细胞发生癌变[17]。据国内外文献报导，HPV感染细胞后诱发感染细胞癌变主要通过以下3种机制：宿主细胞基因组中病毒DNA的整合、E2基因的缺失或沉默、E6和E7基因的保留和过表达[18]，E5蛋白作为癌蛋白也参与了HPV感染细胞癌变的过程[13]。

2.1 HPV DNA在宿主细胞中的整合

近年来有研究表明，多数HPV感染是一过性的，一般在感染后6～12个月通过机体免疫系统作用会转阴，但当机体免疫力下降或DNA发生突变后，部分亚型HPV DNA可随机与感染细胞基因组发生整合，使细胞周期调节系统失控。因此，从宿主细胞感染HPV发展至宫颈癌，HPV DNA随机整合到人类基因组中这一步骤必不可少[19-20]。在人类基因组中，HPV DNA可以与人类基因组中的各个DNA开放阅读框发生随机整合，但其中与结构不稳定的染色体(如3q28、4q13.3、8q24.21、13q22.1和17q21或miRNA簇附近)发生整合的概率更高[21]。而对于HPV基因，其结构不稳定的开放阅读框更易与宿主基因组发生整合，而这些开放阅读框中又以E2基因铰链区结构最不稳定，因此位于3132～3384 核苷酸位置的E2区是病毒与宿主基因组整合发生频率最高的区域，也是整合过程中最常见的缺失或断裂部位，亦为整合过程中HPV基因破坏最严重的区域[22]。E2基因负性调节E6及E7基因的表达，缺失或破坏E2基因，削减了E2基因对E6、E7基因的抑制作用，进而影响细胞的复制及转录过程。此外，HPV DNA与宿主细胞基因组整合后染色体可发生一定变化，如染色体易位、缺失甚至重排，增加了染色体结构的不稳定性，当抑癌基因结构不稳定后，细胞发生癌变的概率将大幅度上升[23]。除此以外，HPV DNA与宿主基因整合并不是致宫颈癌的唯一因素，HPV病毒基因高甲基化也会影响E2基因的转录，虽然没有破坏E2基因的结构，但也间接影响了E6、E7基因的表达[24]。

2.2 缺失E2基因的表达

E2基因在病毒生命周期中发挥了很大的作用，E2基因具有1个DNA结合结构域和反式激活结构域，它们通过富含丝氨酸-精氨酸的铰链区连接，E2基因编码的E2蛋白通常与LCR中的同源序列E2结合位点(E2BS)结合形成同源二聚体，该二聚体中包含病毒早期启动子、复制起点、增强子、多腺苷酸化位点等[25]。黏膜感染性HPV病毒具有4个E2BS，其中2个E2BS靠近病毒早期启动子，第3个位于DNA复制起点，第4个位于增强子区域，E2蛋白与E2BS结合后会刺激或抑制E6、E7癌基因的表达，从而调控病毒的复制周期。已有证据表明，E2在控制病毒早期启动子方面具有抑制功能。当E2蛋白浓度低时，E2将优先与启动子远端2个E2BS结合，导致早期病毒蛋白E6、E7的产生增加。随着E2蛋白浓度的增加，相对于启动子远端的2个E2BS，更多E2蛋白将与启动子近端的2个E2BS结合，通过置换结合位点的特异性蛋白1(specificity protein 1, Sp1)和TATA结合蛋白(TATA-binding protein, TBP)使E6、E7的转录受抑制[26]。另一方面，E2可以与HPV复制过程中的解旋酶相互作用促进DNA复制。如2.1所提及，HPV的致癌过程与HPV病毒与宿主基因组整合密不可分，而与宿主基因组整合后，E2基因铰链区是最常见的缺失或断裂部位，因此整合后的宿主细胞内E2蛋白的表达将大幅度减少，在此情况下，低度的E2蛋白将与启动子远端的2个E2BS结合，使E6、E7蛋白过表达，使感染细胞更易于倾向于永生化，癌变概率增加。

2.3 E6和E7基因的保留与过表达

2.3.1 E6基因 机体细胞通常受到一些内源性因素(如细胞代谢、DNA复制及重组过程中出错)和外源性因素(如紫外线及化学药物作用)的影响，使细胞基因组受损，机体可通过复杂的网络通路识别DNA损伤、激活细胞周期检查点并促进DNA修复或清除机体里的高度损伤细胞[27]。而p53蛋白作为抑癌因子，参与了细胞内的多个信号转导过程，包括细胞增殖、DNA修复，必要时可终止细胞进程，诱发细胞凋亡[28]。因此，p53基因的沉默或突变可能会扰乱细胞内信号转导通路，使细胞生长、凋亡过程失控，从而诱发细胞癌变[29]。当DNA受损程度轻时，机体内p53蛋白表达水平增高，使受损细胞停留在G1检验点，进行DNA修复，从而维持细胞基因组的完整性。当DNA修复失败后p53蛋白则会启动细胞凋亡通路，诱发细胞老化或凋亡，从而减少基因组突变发生的概率[30]。E6蛋白可以与多种宿主细胞蛋白相互作用，如p53，E6AP，MAML1，视网膜母细胞瘤家族蛋白和含锌指结构蛋白，E6蛋白可使这些蛋白质失活从而影响多种细胞途径，如细胞增殖和凋亡。2016年1月，Nature杂志报道了法国斯特拉斯堡大学生物技术学院的Martinez-Zapien教授团队关于HPV介导的p53降解所需的E6/E6AP/P53复合体的构建研究，他们在体外大肠杆菌BL21(DE3)细胞中分别表达了E6、E6AP及p53，在缓冲液B中以1∶1∶1的化学计量比混合，结晶浓缩后纯化，获得初始E6/E6AP/p53复合体晶体，在体外模拟了p53蛋白在复合体作用下降解的过程[31]。E6蛋白通过干扰p53蛋白的功能，诱导p53在蛋白酶依赖系统中的降解。HPV感染细胞内E6蛋白持续高表达，过度表达的E6蛋白可与机体内的E6相关蛋白(E6AP)结合，从而使E6AP与p53蛋白特异性结合。而E6AP又称为泛素-蛋白连接酶(E3A)，与泛素结合后可以诱导p53在E3A系统里的过度降解。当p53蛋白过度降解后其作为抑癌因子作用大幅减弱，细胞DNA损伤时不能及时修复，亦不能及时启动细胞凋亡通路，从而细胞基因组积累了大量突变基因，使细胞癌变概率增加[32-33]。此外，E6蛋白可通过与外源性的细胞凋亡途径中的相关死亡域蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain, FADD)及半胱氨酸蛋白酶-8相互作用抑制HPV感染细胞凋亡，使突变基因量进一步增多[34]。另一方面，E6蛋白与端粒酶活性的调节也有一定关系，有研究表明：与HPV有关的恶性肿瘤细胞中端粒酶的活性大于正常细胞，而端粒酶活性的高低与hTERT(催化亚基人端粒酶逆转录酶)的表达密切相关，而E6蛋白可以促进hTERT的转录。Myc锌指蛋白(Maz)和hTERT上的启动子结合后会抑制hTERT的表达，而E6蛋白可以抑制Maz蛋白活性，从而促进hTERT转录。锌指转录因子Sp1结合hTERT启动子后可以促进其表达，而E6蛋白可以促进Sp1与hTERT启动子结合从而使端粒酶活性增高[35]。因此，E6蛋白的过表达可促使HPV感染细胞癌变。

2.3.2 E7基因 视网膜母细胞瘤基因(RB1基因)编码视网膜母细胞瘤口袋蛋白(pRB蛋白)，pRB蛋白在细胞周期过程中起重要作用，pRB蛋白可与细胞周期调节因子(E2F)结合，抑制E2F转录活性，阻止细胞周期进入S期，从而使受损DNA得以修复，避免将突变基因传递给子代细胞。pRB还可参与调节DNA复制、细胞凋亡等过程[36]。HPV感染细胞E2基因表达受抑制，E7蛋白持续高表达，过度表达的E7蛋白能与pRb蛋白结合，从而抑制其与E2F因子结合，使E2F在细胞内处于游离激活状态，使得细胞在DNA受损条件下仍能向S期进展，细胞不断增殖，使突变基因得以积累，从而诱导感染细胞癌变[37]。此外，E7蛋白还可与P107、P130蛋白结合，机制类似于pRb[38]，E7蛋白亦可拮抗细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)抑制物作用，促进CDK活化，推进细胞周期进入S期，促使细胞周期失去调控[39]。与E6蛋白对hTERT的诱导作用相似，E7蛋白虽不能直接调控端粒酶hTERT的表达，但E7蛋白与E6蛋白协同作用，可上调hTERT启动子活性，从而增加hTERT转录，诱导HPV感染细胞无限增殖甚至永生化，进一步诱使细胞癌变。

2.4 E5基因

关于HPV致癌性和侵袭性的大多数研究都集中在E6和E7癌蛋白的作用上，但是，最近有研究表明，E5癌蛋白在HPV致癌过程中亦具有举足轻重的作用[40]。E5癌蛋白可以通过与生长因子类受体如表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)结合形成活化复合物刺激细胞增殖，从而维持HPV感染细胞的持续增殖状态[41]。E5癌蛋白主要存在于内质网和高尔基体中，E5蛋白可与其中的Ⅴ型ATP酶结合，减少内体酸化作用，而内体酸化是降解细胞表面受体的重要途径。内体酸化作用的失调会导致细胞表面受体(如EGFR)的代谢减少，从而增加其信号转导活性。此外，E5癌蛋白还可以靶向下调角质形成细胞生长因子受体/成纤维细胞生长因子受体2b(KGFR/FGFR2b)信号转导，减少细胞的自噬过程。与E6癌蛋白类似，E5癌蛋白在抑制细胞凋亡方面也有一定作用，E5蛋白可以增加促凋亡蛋白Bax的泛素化和蛋白酶体的降解，从而抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡，增加异常突变基因在细胞内的积累，从而诱发感染细胞癌变。E5癌蛋白的另一重要作用就是对免疫系统的调节，可与主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complex Ⅰ， MHC Ⅰ)相互作用，促进其在高尔基体中的保留，抑制其向细胞表面的转运，从而使MHC I将病毒抗原呈递给T细胞的能力降低。另外CD8+T细胞不能识别E5抗原，从而促进了HPV转化细胞的免疫逃逸。因此，E5基因的表达促进了HPV感染细胞的癌变进程。

3 结 语

近年来宫颈癌的发病率逐渐上升，并且呈现逐渐年轻化的趋势，严重威胁女性的生命安全。常规的治疗方法(例如手术、化学疗法和放射疗法)仍是宫颈癌患者治疗的主要手段，但治疗后仍存在较高的复发率，降低了患者的生存率和生活质量。近年来随着科学技术的进步，逐渐发现了HPV中易与宿主基因随机整合的为E2基因，缺失或破坏E2基因的表达，将会削弱E2基因表达产物对E6、E7基因表达的抑制，使得E6、E7基因过表达，继而将会破坏相应的细胞内信号传导通路，辅以E5蛋白在调节免疫及细胞凋亡方面的协同作用，共同促进了HPV感染细胞的癌变过程。但目前仍有问题亟待解决，如HPV中E2基因与宿主基因整合的具体位点仍不明确，有待于进一步完善，E2基因具体通过何通路抑制E6、E7基因的表达以及E5如何与E6、E7基因协同作用抑制细胞凋亡、促进感染细胞癌变等问题仍有待于进一步研究与发现。因此更加深入的认识HPV结构及了解HPV各基因间的致癌作用及其在抑制细胞凋亡、促进细胞永生化方面的级联作用机制仍是发现、诊断、治疗及预防宫颈癌的关键所在。