广东猪种质资源利用与育种生物技术创新

王塑天，孟繁明，李剑豪

（1.广东省农业科学院动物科学研究所/畜禽育种国家重点实验室/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东 广州 510610；2. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东 茂名 525000）

我国是世界上最早驯化野猪的国家，养猪的历史可以追溯到新石器时代早期。《史记》记载，“留长孺以相彘立名”，表明在汉代我国已开始对猪进行选育。联合国粮农组织数据显示，中国地方猪种质资源约占全世界猪种质资源总数的1/3，是世界上猪种质资源最丰富的国家之一［1］。2011年出版的《中国畜禽遗传资源志-猪志》（以下简称《猪志》）收录了76个中国地方猪品种、18个培育品种［2］。在我国特有的地理位置、气候环境和农耕文化等因素影响下，中国地方猪种形成了肉质好、繁殖力强、耐粗饲、抗病抗逆性强的优点。1770—1780年间，广东地方猪种被引入英国，与约克夏郡和巴克夏郡土猪进行杂交，育成了世界知名的大约克夏猪和巴克夏猪。1816—1817年，我国地方猪种又被引入美国，与当地猪交配并育成了波中猪和切斯特白猪，说明我国地方猪的优良基因影响了全世界范围内良种猪的培育进程［3］。此外，在大白猪、长白猪及皮特兰猪的培育过程中都利用了中国地方猪种，可见中国地方猪种为世界猪品种的培育作出了巨大贡献［4］。但我国地方猪种生长速度慢、瘦肉率低、饲料报酬差等缺点已不符合当前大规模商业化生产的要求。因此如何实现在保留地方猪优良特性的基础上培育出满足市场需求的猪种，是我国地方猪种开发利用工作的重中之重。随着现代生物技术的飞速发展，人工授精、体细胞核移植、干细胞术、全基因组选择分析，以及以CRISPR/Cas9系统为代表的新一代基因编辑技术被相继推出，应用现代生物技术育种将是未来猪育种工作的主要方向之一。

广东养猪历史悠久，猪种质资源丰富，其中大花白猪、蓝塘猪、小耳花猪和粤东黑猪已收录于《猪志》［2］中，是我国重要的地方猪种质资源。广东地方猪与国外瘦肉型猪遗传差异较大，蓝塘猪、小耳花猪和大花白猪的遗传多样性较低，需要进一步加大保种力度；而粤东黑猪存在西方猪种血缘混入的情况，在保护过程中需寻找血统更纯正的群体［5］。了解、保护、发掘和研究广东地方猪种质遗传资源对科学指导地方猪种的保种和利用具有重大意义。将传统育种方法与现代新育种技术相结合是广东地方猪种开发利用的主要技术思路。

1 广东优质猪种质资源特点及利用研究

1.1 蓝塘猪

1.1.1 种质资源特点 蓝塘猪原产于广东紫金县蓝塘、凤安、九和一带，现广泛分布于广东陆丰、河源、惠阳等30多个县市地区。蓝塘猪体型中等，成年公猪体重约104 kg、体长约126 cm、体高约69 cm，成年母猪体重约90 kg、体长约116 cm、体高约61 cm；公猪5月龄即性成熟，母猪3月龄即发情，繁殖年限达8～13年，平均窝产仔约10～12头，肥育期平均日增重397 g左右；具有遗传稳定、耐热性强、早熟早肥、抗逆性好、肉质佳，但生长速度慢、饲料报酬差、瘦肉率低等特点［2］。蓝塘猪中心产区四面环山，形成了自然条件上的隔离，使得当地蓝塘猪长期处于闭锁及高度近交繁殖状态，后代近交系数高达43.8%，但生活能力没有明显下降趋势；在作为杂交母本使用时，杂种优势明显［2］。20世纪70年代初期，蓝塘猪的养殖规模达到顶峰，仅紫金县一地年产蓝塘猪仔猪60余万头；20世纪90年代，随着国外快大型外三元猪种的引入，蓝塘猪的生产规模日益缩减；2006年，东莞板岭原种猪场的蓝塘猪母猪存量减至110头、公猪仅12头；2011年广东蓝塘猪纯种母猪存量不足5 000头［2］。自2018年非洲猪瘟在我国暴发以来，农民散养的蓝塘猪几乎绝迹，现存蓝塘猪主要集中在韶关新丰板岭原种猪场（6个血缘）和河源东瑞食品集团有限公司灯塔种猪场。

1.1.2 研究现状 20世纪90年代，在蓝塘猪没有集中保种前，以吴同山教授为代表的一批科研工作者，先后对从紫金县搜集的6个血缘62头蓝塘猪进行保护、扩群，20多年累计向社会提供了万余头优质蓝塘猪猪苗及商品猪［6］。蓝塘猪由于具有高度近交、杂种优势明显等特点，被我国许多学者、企业视为重要的本地猪育种材料。研究表明，成年蓝塘猪屠宰率约67.61%，瘦肉率为45.19%［7］，对其生长速度、瘦肉率性状进行遗传改良是近年来蓝塘猪培育的研究重点。目前广东蓝塘猪的遗传改良和利用工作已初具成效。束刚等［8］比较了蓝塘猪与长白猪正反交F1代的胴体性状和肉品质，其中蓝塘猪×长白猪的肌内脂肪含量显著高于长白猪×蓝塘猪，且公猪肌内脂肪显著高于母猪。此外，蓝塘猪×长白猪肌肉中的花生四烯酸（C20∶4）比例显著高于长白猪×蓝塘猪，表明了蓝塘猪×长白猪组合的猪只具有更好的肉品质和营养价值。李威等［9］研究发现，蓝塘猪与长白猪正反交F1代的肌肉脂肪酸组成均以棕榈酸、硬脂酸和亚油酸为主，蓝塘猪×长白猪背最长肌的多不饱和脂肪酸比例、C18∶2比例均显著低于长白猪×蓝塘猪。肖正中等［10］研究发现，长白猪×蓝塘猪F1代与父母代之间基因组DNA的甲基化水平存在明显差异，这些差异可能是影响后代杂种优势的原因之一。杨伟钧等［11］分析了蓝塘猪和长白猪骨骼肌卫星细胞的增殖分化差异，结果显示，两者在增殖分化初期就表现出差异，而且蓝塘猪骨骼肌卫星细胞的增殖能力、分化能力均好于长白猪；长白猪半膜肌中Myf5的表达显著高于蓝塘猪，MyoD、Myostatin和Pax7mRNA表达水平在长白猪背最长肌和半膜肌中高于蓝塘猪。吴娥丽等［12］分析了蓝塘猪印记基因IGF2和H19的时空表达水平，结果显示，仔猪肝脏、肌肉中IGF2表达水平较高，而180日龄蓝塘猪脂肪、肝脏、胃中IGF2的表达水平均低于同期的长白猪，180日龄蓝塘猪肾脏组织中的H19表达量较高；研究表明，IGF2是影响脂肪沉积性状的候选基因，蓝塘猪IGF2基因的表达量与肌肉组织发育呈正相关，而与背膘厚度、皮质厚度呈负相关。IGF2基因功能的丧失或减弱会造成成年猪肌肉量下降，而脂肪、背膘厚增加，但对肌内脂肪含量无显著影响，说明IGF2是提升蓝塘猪瘦肉率极具价值的的候选基因之一。此外，Yang等［13］研究发现，肥胖型蓝塘猪脂肪、背最长肌和肝脏组织中的CIDEc基因，以及脂肪组织中与脂质代谢相关的SREBP-1c、FASN、HNF-4α、PGC-1α、DGAT1/2基因表达量均显著高于瘦肉型猪；相关性分析结果显示，CIDE家族基因通过影响脂质代谢，促进脂肪沉积，最终导致肥胖型蓝塘猪瘦肉率低的性状。以这些基因作为分子遗传标记辅助选择育种，或作为基因编辑育种的靶点，有望实现对蓝塘猪胴体过肥、生长缓慢性状的改良。这些研究为蓝塘猪的种质资源利用提供了基础数据，并说明蓝塘猪在杂交利用和生物技术育种方面具有巨大潜力。

1.2 小耳花猪

1.2.1 种质资源特点 小耳花猪原产于广东西江以南及粤西，中心产区在茂名，目前分布于湛江、肇庆等30多个县市，属于华南型猪种，是两广小花猪的一个分支［2］。经检测证实，目前广东小耳花猪群体血统纯正，几乎没有外来猪种血缘混入，表明广东对小耳花猪的保护工作到位［14］。小耳花猪体型较小，具有早熟早肥、皮薄肉嫩、肌内脂肪含量高、肌纤维小、耐粗饲、适应高温多湿环境、繁殖能力强、母性好等优点，是广东养殖最多的地方猪品种之一。小耳花猪成年育肥后体重约70 kg，胴体长101 cm；种公猪2月龄出现性行为，3月龄体重达到30 kg即可配种，母猪4月龄左右开始发情，6月龄体重达40 kg以上即可开始配种，使用年限10～12年。小耳花猪母猪初产平均窝产仔10.72头，经产母猪可达12.13头。小耳花猪由于生长速度快、体型较小且繁殖力强，也被许多科研工作者用以制备医学疾病模型。1979年广东小耳花猪母猪存栏达41万头，虽然外国种猪的引进对小耳花猪的养殖造成了一定影响，但随着21世纪以来烤乳猪和土杂猪备受消费者青睐，小耳花猪的养殖量有所回升。但当前非洲猪瘟在我国暴发，致使广东地区民间散养的小耳花猪几乎绝迹，目前小耳花猪主要由壹号食品股份有限公司和陆川县良种猪场饲养。

1.2.2 研究现状 小耳花猪肉质鲜嫩但生产速度慢，而外来猪种生长速度快但肉品质风味差，许多研究人员利用小耳花猪与外国种猪进行杂交育种，以期获得在生长速度和肉品质方面的全面提升。小耳花猪具有显著的杂种优势，当前其遗传改良和利用主要以提高生长速度、瘦肉率和繁殖性能为目标。韦明飞等［15］研究认为，小耳花猪母猪的繁殖性能主要受胎次影响，及时淘汰超龄母猪并将群体维持在一个适宜的胎龄分布中，可以提高群体的繁殖性能。张洁等［16］研究了广东小耳花猪与杜洛克杂交的效果，结果显示，杜洛克×小耳花与纯种小耳花猪相比胴体重提高了86.15%，背膘厚降低了3.2 mm，瘦肉率提高了11.76 %，而肉品质较纯种小耳花猪没有明显降低。李闯等［17］研究结果显示，巴克夏猪×小耳花猪的杂交后代在育肥阶段日增重达到667 g，料肉比为3.35；成年屠宰后，瘦肉率为43.12%，肌内脂肪含量达到4.27%，肉色评分为5.58分，剪切力（嫩度）为37.35 N。该结果表明巴克夏猪×小耳花猪杂交后代在生长性能方面保持了父本巴克夏猪生产速度快、瘦肉率高的特点，优于小耳花猪；同时肌内脂肪含量高，肉质细嫩、大理石纹丰富的母本小耳花猪特性也得到了保留，是一种有推广潜力的优质杂交模式。谢水华等［18］研究结果显示，杜洛克猪×长白猪×小耳花猪杂交后代育肥期平均日增重高达610 g，显著高于纯种小耳花猪的260 g，同时瘦肉率达到44.50%，这可能成为一种较为理想的杂交模式。小耳花猪母猪繁殖性能属于低遗传力性状，估计值约0.009～0.227［19］，广东壹号食品股份有限公司对2 548窝小耳花猪新品系总产仔数和产活仔数遗传力及性状间的遗传相关进行估计，结果显示其总产仔数和产活仔数遗传力均为0.16，其繁殖性能改良备受关注。此外，有学者通过基因编辑技术获得了MSTN基因突变的小耳花猪［20］。Wei等［21］分别利用CRISPR/Cas9技术构建了IGF2和MSTN突变的胎儿成纤维细胞株，通过核移植方法制备了基因编辑小耳花猪，MSTN基因通过抑制AKT信号活化从而影响蛋白合成，控制小耳花猪肌肉生长；IGF2基因第3内含子突变导致ZBED6结合位点被破坏，进而上调骨骼肌IGF2的表达。研究表明，基因编辑猪338日龄体重可达90 kg，远高于同期野生型小耳花猪的69 kg。以上这些性状都是通过常规杂交育种难以获得的优良性状，展现了现代分子育种技术在猪育种中巨大的优势。

1.3 大花白猪

1.3.1 种质资源特点 大花白猪主要分布于广东粤中、粤北地区，由大花乌猪、金利猪、梅花猪、梁村猪、四保猪和坭坡猪合并而来，粤中系体表黑毛覆盖率低于粤东、粤北两系。大花白猪体型中等，具有繁殖能力高、耐热耐潮性好、性成熟早、沉脂能力强、耐粗饲等优点，在广东地区多被作为杂交母本使用［2］。成年公猪体重约109 kg，成年母猪体重约112 kg。大花白猪的繁殖性能良好，窝产活仔数平均11.33头，出生个体重约0.72 kg，母猪乳头数平均为12.33个；平均日增重475 g、料肉比3.95，背膘厚4.61 cm，瘦肉率41.5%［22］。作为肉脂兼用型猪种，大花白猪较长的生长周期、较低的瘦肉率难以满足现代市场需求，限制了其商用发展。目前有百余头大花白猪饲养于韶关市畜牧研究所和新丰板岭原种猪场。

1.3.2 研究现状 师科荣等［23］报道大花白猪在MC1R基因6、61、284、309、364、730位点存在突变，这些突变影响了猪毛色性状，此外MC1R基因还与动物瘦肉率、生长速度、体高、体长、疾病以及动物行为有关联性，可以作为大花白猪遗传改良的候选基因。Myl1编码的不同剪切体与动物骨骼肌肌纤维类型相关。凌飞等［24］研究发现，在大花白猪基因组中Myl1基因启动子区多态性丰富，而在杜大长瘦肉型猪中只有单一的基因型，提示Myl1基因可能是大花白猪肉品质改良的候选基因。杨舟等［25］研究了与蛋白质合成、能量代谢、血管形成和细胞增殖相关的eIF4E、PPARGC-1、VEGFA、C-Jun基因，并比较了这4个基因在大花白猪、蓝塘猪和长白猪上的表达差异，发现eIF4E和PPARGC-1基因在不同品种中影响肌肉形态和肉质。代发文等［26］研究发现，大花白猪背最长肌中肌酐含量远低于蓝塘猪，提示这两种广东地方猪在肌肉能量代谢方面可能存在一定差异。王敬军等［27］进行大花白猪杂交育种试验，结果显示，其与长白猪的F1代日增重可提升到583 g，瘦肉率约49%；用长白猪与F1代回交得到的后代，瘦肉率可达56.2%，表明杂交育种对大花白猪经济性质有较大提升。IGF-1R信号调控细胞增殖、生长、分化、存活等一系列活动，与IGF1结合发挥作用，而IGF1普遍被认为是促进生长发育的重要候选基因。李仕新等［28］研究发现，IGF-1R在大花白猪心、肺、肌肉、垂体中的表达显著高于长大二元杂猪，对IGF-1R的5' CpG岛预测结果显示，在基因组中该基因约60%～90%的CpG存在甲基化，提示该基因可能影响大花白猪肌肉生长和脂肪沉积，是潜在的候选基因。20世纪80年代许振英先生研究中国地方猪种特性时发现，大花白猪的抗病性能突出［29］。研究发现，在大花白猪乳铁蛋白基因启动子上存在10个有别于长白猪的SNP，这些SNP可能通过影响启动子转录活性调控乳铁蛋白的表达，而乳铁蛋白可以通过抑制病原微生物生长复制，从而影响猪机体的免疫力和抗病力［30］。通过对这些SNP的分析，有望获得大花白猪抗病育种的分子标记。近十多年来广东大花白猪保种工作卓有成效，其群体数量不断增加，但现阶段对大花白猪的保种工作仍需继续推进。将活体与细胞保种相结合，争取申请专项品种保护基金，并引导企业与科研单位共同开展大花白猪的利用，都是持续做好大花白猪保种、利用工作的有效手段。

1.4 粤东黑猪

粤东黑猪由惠阳黑猪和饶平黑猪归并而来，其中心产区位于广东潮州饶平、梅州蕉岭和惠州惠阳。粤东黑猪体形大小适中，额扁而宽，耳小而斜，嘴长而尖，躯体呈长方形，腹大但不拖地，四肢结实、长短中等，后腿肌肉较发达，具有皮薄骨小、耐粗饲、繁殖力强、母猪使用年限长、杂交优势好等特点［2］。公猪体重约55 kg，体长约86 cm；母猪体重约62 kg，体长约95 cm；胴体重为41.16 kg，背膘厚为3.25 cm，瘦肉率为48.56%；公猪5月龄性成熟，体重达到45 kg开始配种，母猪3月龄左右开始发情，第2～3次发情时开始配种，使用年限可达8～13年，窝均产仔数10～12头。肥育阶段粤东黑猪的平均日增重为230～250 g［31］。粤东黑猪作为广东地方古老、优秀的品种，一度因肉质鲜美、皮薄骨细作为烤乳猪用猪种而倍受消费者喜爱。20世纪80年代广东粤东黑猪母猪存栏约4万头，但随着国外猪种的引进推广，其存栏量急剧下降，目前主要饲养于梅州蕉岭泰农国家级粤东黑猪保种场。近年该公司出栏粤东黑猪500余头，但受非洲猪瘟影响，目前饲养规模有所缩减，总体处于濒危状态，加大粤东黑猪保种工作力度刻不容缓。粤东黑猪具有毛色纯、瘦肉率较高的特性，是杂交利用的良好素材，但至今有关粤东黑猪种质资源的利用研究寥寥。

2 现代生物技术在地方猪育种中的应用

随着我国经济与科技的发展，我国居民对猪产品质量的要求逐年提高。目前我国已经成为全世界最大的猪肉生产和消费国，猪产业的健康发展关系到我国民生问题。在诸多影响猪产业的因素中，猪种质资源的优劣及其利用是最核心的问题。在过去几十年中，传统育种技术主要是通过杂交或其他手段在群体中创造新的变异，再通过人工干预选择的方式获得新品种。这种技术手段曾为猪品种选育作出过巨大贡献，但通过该方法获得的变异往往存在盲目性、随机性和不可预测性，从而导致选育结果的不确定性，而且这种选育方法需要一定规模的群体以及长达十几年的试验周期，选育进程漫长且进展缓慢。随着2005年猪全基因组测序工作的完成，通过基因序列了解基因功能，建立基因和性状之间的联系越来越重要。下面综述近年现代生物技术在我国地方猪育种中的应用，以期为广东地方猪育种工作提供参考。

2.1 繁殖生物技术

2.1.1 人工授精 繁殖生物技术是综合细胞生物学、繁殖生物学和遗传学的理论方法，控制生物遗传与繁殖过程的技术方法，主要包括人工授精、胚胎移植、精子分离、生殖细胞移植、核移植等技术。在猪育种工作中应用最多的是人工授精技术与核移植技术。近十几年来，在世界前十的猪肉生产大国中，其他国家在猪生产环节中人工授精技术的覆盖率达90%以上，而我国仅有40%［32］，因此我国猪人工授精技术仍需进一步普及推广。人工授精技术对我国地方猪育种工作的影响可概括为以下方面：（1）人工受精可以获得大量优秀种公畜后代，使得优良性状和基因在群体中的比例快速提高。（2）通过冷藏运输，优秀公畜的使用不再受地理因素的限制，同时也可以减少家畜运输过程潜在的成本及疾病传播问题，尤其是在如今非洲猪瘟蔓延的关键时期。（3）我国大多数地方猪种数量少且生长速度相对缓慢，通过人工授精可以大大减轻每头优秀种公畜的配种任务，减少种公畜的使用量，从而提高选择强度，加快遗传进展。（4）人工授精技术是联合育种中的关键技术，通过交流公猪精液可以有效增加猪场间的遗传联系，使得区域性甚至全国性联合育种成为可能。通过将有相同育种目标的种猪场联合起来，形成一个数量巨大的“超级”核心群，并开展统一的性能测定，进行遗传评估，从而选择出最优秀的公猪，供各场共享使用，可加快育种进展，提高群体性能水平。

2.1.2 体细胞核移植 克隆即体细胞核移植，指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，所获得后代的基因型与供体细胞完全相同，是重要的繁殖生物技术之一。2000年，Polejaeva、Onishi和Bondioli科研团队分别通过3种不同的方式获得了体细胞核移植克隆猪［33-35］。随后我国多家实验室也成功克隆了多种地方猪，如刘忠华等［36］通过优化培养基成分提高了卵母细胞成熟率和成熟质量，并通过体细胞核移植技术获得了14头克隆民猪；卢晟盛等［37］通过改进重构胚制备、激活及优化培养条件，获得了1头体细胞核移植巴马公猪；叶雷等［38］和Wei等［39］成功克隆版纳猪12头，微卫星分析结果表明所有克隆仔猪的基因型与供体细胞完全相同。利用体细胞核移植技术克隆优秀的种畜，可以快速实现优良性状的稳定遗传并可以在短期内提高优良基因的频率，使存量较少的优秀地方猪个体得到充分利用。在国内三元杂交猪的市场占有率高，加之非洲猪瘟蔓延导致大量农民散养的地方土猪死亡数量激增。相较于活畜保种方法成本投入高且保存品种及个体数量有限，而冷冻生殖细胞保存种质资源的方法受到移植效率、取样数量有限、生产制备费用高等因素影响，且还存在发生基因漂移和基因丢失的可能，体细胞核移植技术对拯救濒危地方猪种有巨大应用价值和潜力。

2.2 基因组选择

早在2001年，Meuwissen提出了基因组选择（Genomic selection，GS）的概念，而现在GS技术主要指利用全基因组范围内遗传标记来估计不同染色体片段或者标记效应的累加值进而获得基因组估计育种值。随着多种动物全基因组测序的完成和SNP芯片利用越来越广泛，在分型技术和全基因组关联分析技术的基础上，全基因组选择技术得到迅速发展。与之前的标记辅助选择技术相比，GS可以同时对多种性状进行选择。而基因组选择的确定性依赖标记密度、表型测定的准确性、分型个体数量以及群体品种等因素。由于基因组选择利用物种的信息最全面，选择的准确性将得到最大保证，是当前畜禽育种的主要研究方向之一。与传统选择方法相比，基因组选择可以提高对低遗传力性状、难以测量的性状、限性性状以及抗病能力等性状估计的准确性，甚至可以在生物体尚处于胚胎阶段就进行基因组估计育种值预测，从而缩减世代间隔，加快遗传进展。但如何针对地方猪种制定适合的基因组选择方案，仍需要开展相关科研工作进行长期摸索。目前基因组选择已应用在我国地方猪遗传改良工作中。Yang等［40］使用F统计量离群值方法确定了中国地方猪和商品猪之间具有表达差异的基因组区域，这些区域涉及影响猪组织器官发育、免疫反应、生长和产仔数等多种性状。Chen等［41］通过对荣昌猪全基因组进行测序分析，鉴定出449选择标记，主要涉及生长和激素结合、神经系统发育和药物代谢。这些基因的加速进化可能是荣昌猪与中国野猪表型差异显著的原因之一。这些研究为提高我国地方猪在农业生产和生物医学研究领域中的应用提供了思路。

2.3 干细胞技术

猪干细胞研究始于1990年，Evans等［42］将猪植入前胚胎与小鼠成纤维细胞共培养，使得猪胚胎细胞在未分化状态下持续生长。2009年Ezashi等［43］将人OCT4、SOX2、C-MYC和KLF4转录因子导入猪胎儿成纤维细胞，得到具有正常核型的iPSCs。2013年赖良学研究团队以猪iPSCs作为供体细胞获得了一批健康的克隆猪［44］。2016年我国学者刘忠华研究团队成功分离猪ESCs，并可以稳定培养传代75次以上，这些细胞都表达OCT、SOX2等经典干细胞标志物［45］。2017年王寒凝［46］成功将猪iPSCs诱导为生殖细胞样细胞，随后该细胞还可以继续分化为精原干细胞样细胞。干细胞技术有望改变现有的动物育种系统，利用ESCs、原始生殖细胞（PGCs）和iPSCs，可以在体外水平诱导形成完整的配子。在自然条件下，动物配子发生需要等到性成熟以后，往往需要几个月。在小鼠中的研究表明，仅需1个月就可以在体外水平诱导产生生殖细胞。我国不少地方猪资源稀缺，且生长缓慢，世代间隔长，动物干细胞育种系统通过整合体外生殖细胞诱导、体外受精、全基因组测序和基因组选择技术，即可在细胞培养皿中完成畜禽育种，采用这种方法可以显著缩短世代间隔，提高选择强度，在短时间内提高几十倍的遗传进展速度，是一种极具应用潜力且适用于我国地方猪当前情况的育种策略。此外，干细胞具有多能性，经过培养具有增殖及多向分化的潜力，联合核移植技术，可以获得与供体完全相同的个体，对于保护珍稀地方猪种质资源意义重大。

2.4 基因编辑技术

基因编辑作为一种新兴的基因工程技术，可以精确地对生物体基因组特定基因序列进行修饰改造。近10年来随着基因编辑技术的高速发展，锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样受体因子（TALEN）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）系统先后被应用于对生物体内源基因的精确改造。目前基因编辑技术在人、小鼠、斑马鱼、猪、牛、山羊、绵羊、兔、猴子等物种中已有应用。基因编辑技术不仅可以直接在核酸分子水平对目的基因进行精确修饰，也可以打破物种间的生殖隔离甚至是动物、植物、微生物间的界限进行基因转移，并可以在极短时间内获得其他育种方法无法获得的动物新品种，同时也扩展了育种的边界，也为地方猪种质资源利用提供了更加精准、快速的策略。

2013年CRISPR/Cas9系统被提出后，这项新的基因编辑技术引领了全世界范围内的研究热潮。基因编辑技术在猪遗传育种中的应用主要包括提高生产性能、改善猪肉品质、提高猪抗病能力、降低养猪废物对环境的污染、为器官移植提供原材料、构建动物疾病模型等方面。该技术为精准、快速改良我国地方猪生长慢、瘦肉率低等性状提供了工具，也可以充分利用小耳花猪、巴马猪、藏猪等小型猪制备动物疾病模型，为医学研究提供材料。2014年，Sato等［47］率先利用CRISPR/Cas9系统在猪胎儿成纤维细胞中实现对α-1,3-半乳糖基转移酶双等位基因的敲除；同年Hai和Whitworth等［48-49］分别通过胚胎显微注射的方法成功制备了基因编辑猪。MSTN及CD163基因编辑猪的出现表明，通过基因编辑技术对猪种进行改良可以创造出传统育种难以获得的新性状。2015年Wang等［50］利用CRISPR/Cas9技术对猪成纤维细胞中的MSTN进行定点突变，随后通过体细胞核移植获得了MSTN双等位基因敲除的基因编辑猪，MSTN基因的缺失突变导致猪肌肉肥大，表现出双肌性状，极显著地提高了瘦肉率，因此MSTN在猪育种研究中具有重要的研究价值和意义。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）辅激活因子1α（PCG1α）通过诱导线粒体合成调控肌纤维类型的转化，对猪肉品质造成影响。华中农业大学利用基因编辑技术制备的转基因猪证实了PCG1α基因可以将酵解型肌纤维转化为氧化型肌纤维，可作为猪肉质改良的靶基因［51］。

对动物抗病性能的选育往往是传统育种难以实现的任务，其中猪繁殖与呼吸综合征是猪产业中最为严重的疾病。 2014年由Whitworth等［52］利用CRISPR/Cas9系统获得的CD163敲除基因编辑猪显示出对蓝耳病病毒的耐受，是猪育种工作的重大突破。随着猪养殖集约化程度日益提高，猪场排污问题受到广泛关注。华南农业大学吴珍芳研究团队［53］利用生物技术将4种微生物酶类在猪唾液腺中特异性表达，使得猪粪便中氮磷排放量下降20%。此外，已有学者将CRISPR/Cas基因编辑技术引入中国地方猪育种体系中，陈瑶生研究团队先后利用广东小耳花猪制备了IGF2及MSTN突变的基因编辑猪，这些基因工程猪生长速度加快、瘦肉率明显提高［54-56］。基因编辑技术由于具有高效性与准确性的优点被研究者广泛应用。目前基因编辑技术已经向多基因同时进行修饰的方向发展，有望为将来大规模改良动物遗传性状奠定基础。

3 展望

20世纪80年代开始，国内生猪市场需求由脂肪型猪转向瘦肉型猪，以杜洛克、长白、大白为代表的国外猪种，因生长速度、瘦肉率更符合市场需求，对我国地方猪品种造成了巨大冲击，众多地方猪种曾濒临灭绝边缘。此外，70年代末至90年代初，全国范围内开展地方猪与瘦肉型猪杂交选育以改良本土品种，并育成了湖北白猪等一系列品种，但受限于当时社会经济水平和基层对种质资源的认识水平，保种工作并未同步开展，导致我国本土猪种血缘混杂。后期虽在国家畜禽遗传资源委员会倡导下对部分品种进行提纯复壮，但通过传统方法进行世代选育效率不高，工作进展缓慢。而且由于大多数本土猪种经济效益不及国外品种，导致保种场生产经营困难，改善生产条件意愿不强，至今仍采用半开放式猪舍，整体生物安全水平低，面对如非洲猪瘟等重大疫病缺乏有效的防御手段。因此，如何做好广东地方猪种质资源的保护与创新利用是目前亟待解决的问题。鉴于此，提出今后的工作方向：一是明确地方猪种的市场定位，加大品种标准编制和地理标志产品申报，做好特色经济，重视中高端猪肉市场，发挥地方猪种的肉质优势是行业发展的出路；二是应用基因标记辅助选择、基因芯片等新技术加快品种提纯的速度；三是由政府主导建设高生物安全水平的保种场，并引导、支持现有保种场提高生物安全水平；四是加快新技术的推广应用，利用地方品种全基因组信息持续挖掘品种特色性状与新性状，并加强地方猪种优势基因的挖掘和专利保护；五是加快干细胞等技术在地方品种开发和保护中的应用，利用多种类型的细胞进行保种，并探究地方猪种在实验室细胞培养水平下进行快速育种的可能，同时探索利用基因编辑技术创造育种新性状的可能；六是开发医学实验动物市场，地方猪种应用的思路不应局限在食品方面，部分体型小、繁殖快的地方猪种是作为医学实验动物的良好素材。