干细胞治疗退变性椎间盘疾病的研究进展

杨帅 吴晓淋 刘畅 王晓雄 王岩 郭柱 张国庆 相宏飞 陈伯华

椎间盘位于相邻椎体之间，由外周的纤维环 ( annulus fibrosus，AF )、中央胶冻样髓核 ( nucleus pulposus，NP ) 组织以及上下两端薄层透明的软骨终板 ( cartilage endplate，CE ) 组成。外周纤维环主要由类似成纤维细胞的纤维环细胞组成、髓核组织的主要细胞类型为星状软骨样细胞、软骨终板则是一层与关节软骨组织相似的薄层软骨[1]。椎间盘退变 ( intervertebral disc degeneration，IDD ) 是指由细胞介导的进行性结构衰竭的异常反应[2]。退变的发生会导致椎间盘内环境稳态的失衡，组织的水合作用丧失、炎症发生以及细胞外基质的丢失，进而导致椎间盘高度降低、纤维环结构破坏，逐步丧失正常的生理结构和功能[3]。由于椎间盘是人体内最大的无血管结构，内部细胞的物质交换仅依靠于软骨终板上微孔结构的弥散作用进行[4]，因此 IDD 很难通过其自身修复，具有不可逆性。鉴于此特点，越来越多的团队开始使用干细胞对 IDD 过程进行干预，以达到减缓 IDD 进程或修复退变椎间盘的目的，包括间充质干细胞 ( mesenchymal stem cells，MSC )、椎间盘源性干细胞 ( intervertebral disc-derived stem cell，IVDSC )、多能干细胞 ( pluripotent stem cells，PSC ) 等在内的一系列方法为退变性椎间盘疾病 ( degeneration disc disease，DDD ) 的治疗及相关研究带来了新思路、新策略，被认为具有良好的应用前景。现笔者就当前科研与临床治疗中干细胞及相关技术的新研究、新进展进行归纳总结，作如下综述。

一、退变性椎间盘疾病

由 IDD 引起的 DDD 是包括盘源性腰痛、腰椎间盘突出症等在内的一系列疼痛性脊柱疾病[5]。大部分患者的临床症状可以通过休息或保守治疗得到缓解[6]。此外，可进行皮质类固醇、局部麻醉药物和其它多种药物的封闭治疗，但尚未有明确的治疗效果[7]。当上述治疗手段无效时，人们通常选择外科手术的方法对这类疾病进行干预治疗，以此来减轻临床症状、提高生活质量。但上述治疗手段均无法逆转退变椎间盘的病理状态，且术后并发症发生率较高[8]，甚至可以加速邻近节段 IDD。并且，外科手术的干预改变了椎间盘或脊柱的正常生物学特性，使其丧失了部分或全部的自身修复的机会。随着对 IDD、DDD 相关机制的逐步了解以及干细胞技术的不断发展，使用干细胞移植等组织工程方法来修复退变椎间盘、恢复椎间盘或脊柱的正常生理结构和功能越来越为人们所重视。

二、间充质干细胞

MSC 是一种具有多向分化能力的 PSC，其来源广泛、易于获取。MSC 最常见的来源是骨髓和脂肪组织。

1. 骨髓间充质干细胞 ( bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC )：BMSC 是骨髓内的非造血干细胞，其来源广泛，相对较易获取，是当前研究最多的 MSC 种类之一。既往研究表明，骨形态发生蛋白 7 ( bone morphogenetic protein 7，BMP-7 )[9]、骨形态发生蛋白 3 ( bone morphogenetic protein 3，BMP-3 )[10]与转化生长因子 β1 ( transforming growth factor beta 1，TGF-β1 )[11]等生物因子可以诱导 BMSC 增殖分化为髓核细胞表型，促进细胞外基质的产生，且 BNP-3 与 TGF-β1 之间具有协同作用，从而能够进一步加强了对 BMSC 的分化诱导。这表明，合适的基因转染能够促进 BMSC 的髓核样表型，且不同的基因之间存在一定的协同作用。

Li 等[12]在体外进行大鼠 BMSC 与髓核细胞共培养的实验中发现，与 BMSC 的共培养能够减少衰老髓核细胞中 β-半乳糖苷酶表达、促进细胞增殖、降低基质金属蛋白酶 9 ( matrix metalloproteinase 9，MMP9 ) 的合成，同时增加 Coll-IIa 产量；此外，髓核细胞中锌金属肽酶 STE24 ( zinc metallopeptidase STE24，ZMPSTE24 ) 的表达在与 BMSC 共培养后得以恢复，抑制了 TGF-β / NF-κB 信号转导通路的促衰老作用，从而达到减缓或预防髓核细胞纤维化的目的，恢复其细胞活力。Lehmann 等[13]在进行 BMSC 与髓核细胞直接共培养与间接共培养时，不仅发现 BMSC 能产生髓核细胞表型，而且还发现与间接共培养相比，两种细胞在进行直接共培养时，在细胞膜之间形成了一种类似隧穿纳米管 ( tunnelling nanotubes，TnT ) 的结构，说明这种类 TnT 样结构能够促进 BMSC 的表型变化，进一步揭示了两种细胞之间通讯的分子机制，为后续研究打下坚实的基础。Lu 等[14]研究发现，细胞通讯机制之一的外泌体 ( exsome ) 在干细胞的诱导分化中起到了重要作用；该研究团队发现髓核细胞来源的外泌体能成功将 BMSC 诱导分化为髓核细胞表型，且 BMSC 来源的外泌体能够促进退变髓核细胞相关基因的表达、增加细胞外基质的含量，从而促进退变椎间盘的自我修复。类 TnT 样结构和外泌体的发现为 BMSC 的诱导分化提供了新途径，对其通讯机制的进一步研究能够为 BMSC 的生物学治疗方法提供新的突破点。

在动物模型水平的研究中，研究者进行了一系列的 BMSC 移植实验，证明了 BMSC 修复退变椎间盘的有效性。其中，Hussain 等[15]使用载有 BMSC 的脱细胞高密度胶原蛋白 ( high density collagen，HDC ) 凝胶接种到纤维环受损的绵羊椎间盘内，接种后 6 周进行相关数据的统计处理，接种载有 BMSC 的凝胶的实验组在椎间盘高度指数 ( disc hight index，DHI )、Pfirrmann 等级，髓核面积以及 T2松弛时间 ( T2-RT ) 方面的数据明显优于其它实验组；组织学结果表明，受损纤维环和髓核的组织重建和修复得到明显改善。此外，Lykov 等[16]使用过氧化氢诱导氧化应激条件，模拟退变椎间盘的微环境，然后将 BMSC 与促红细胞生成素 ( erythropoietin，EPO ) 混合后注入大鼠退变椎间盘内，MRI 和组织学结果证实了受损椎间盘的高度以及髓核细胞组成均得到明显改善，并且在氧化应激条件下 EPO 能够抑制 MSC 的迁移活性，这可以促进 MSC 在注射部位的局部蓄积，进而刺激再生。由此可知，BMSC 对退变椎间盘具有一定的修复作用，且 EPO 的使用能够保证 BMSC 的修复作用在退变椎间盘的恶劣微环境中的稳定发挥；同时也提醒人们其它激素是否还有类似作用能够保证干细胞促修复作用的稳定进行，为干细胞治疗技术的进一步发展提供了思路。

基于动物模型实验的成功开展，研究人员逐步将 BMSC 移植用于临床研究。Orozco 等[17]将自体 BMSC 注入 10 例伴有腰椎 IDD 的慢性腰痛患者的退变椎间盘髓核内，注射后 1 年的跟踪随访示患者腰痛症状明显减轻，MRI 表明椎间盘含水量在第 12 个月时明显升高，但椎间盘高度无明显改变。随后，Centeno 等[18]将自体 BMSC 在体外培养后注入 33 例经 MRI 诊断为椎间盘膨出的腰背痛患者的病变椎间盘内，然后对所有患者进行长达 6 年的跟踪随访，33 例中大多数人的疼痛明显减轻，脊柱功能较前增强，膨出的椎间盘尺寸减小；仅报告 3 例被主治医师认定为手术相关的轻微不良事件，3 例不良事件均与疼痛相关且疼痛均已缓解，另有 2 例在后期接受了手术治疗。整体未发生死亡、瘫痪或神经病变等严重的安全问题及临床并发症。由此可见，自体 BMSC 治疗 DDD 的有效性及安全性得到了很好验证，这说明 BMSC 的临床应用是安全可行的。Pettine 等[19]选取了 26 例具有脊柱融合术或椎间盘置换术手术指征的病例，将自体 BMSC 注入病变椎间盘髓核内。注入后 12 个月的 MRI 结果表明退变椎间盘得到明显的改善；注入后 36 个月，只有 6 例进行了手术治疗，其余 20 例的 Oswestry 功能障碍指数 ( oswestry disability index，ODI ) 和疼痛视觉模拟评分 ( visual analogue scale，VAS ) 同样得以改善，所有患者没有发生与骨髓抽吸或注射相关的不良事件，该实验结果拓宽了自体 BMSC 治疗 DDD 的临床适应证。Noriega 等[20]使用同种异体 BMSC 对 12 例明确为腰椎 IDD 且保守治疗无效的慢性腰痛患者进行移植治疗，1 年的跟踪随访表明，12 例无不良事件发生且 VAS、ODI 均有明显改善，MRI 结果提示患者的 Pfirrmann 分期也显著改善；这说明异体 BMSC 同样可以应用于 DDD 的治疗，更重要的是，与自体 BMSC 移植相比，前者具有更高的同质性，治疗成本更低，可以应用在患有自身免疫性疾病的患者体内；同时，该研究团队表明：在该研究项目中，同种异体 BMSC 移植的治疗效果比自体 BMSC 移植稍差，这就需要纳入更多的临床样本、比较不同的细胞类型进行更长时间的跟踪调查，从而确定两者的治疗效果。

有限的临床研究表明 BMSC 移植能够用于 DDD 的临床治疗，其安全性也得到了很好的验证；自体 BMSC 治疗的临床适应证正逐步扩展；同种异体 BMSC 的应用拓宽了干细胞的来源范围，但总的来说，当前的临床试验纳入的临床样本数较少，长期疗效还未得到验证，有待下一步相关试验的开展。

2. 脂肪间充质干细胞 ( adipose derived mesenchymal stem cell，ADMSC )：ADMSC 是在脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，其来源广泛且易于获得，是当前干细胞治疗 DDD 的研究热点。有研究表明，与 BMSC 相比，ADMSC 的髓核细胞样分化能力更高，因此 ADMSC 可能更适合应用于 DDD 的治疗[21]。Clarke 等[22]研究发现，与 BMSC 相比，在 TGF-β1、GDF5 或 GDF6 的诱导下，ADMSC 分化为髓核细胞表型的能力更强，细胞培养基内硫酸糖胺聚糖、COL II 等细胞外基质水平明显增高。Han 等[23]进行的 ADMSC 与退变髓核细胞的体外共培养不仅证明了 ADMSC 能促进退变髓核细胞的修复，而且首次全面地鉴定了与 ADMSC 共培养时变退变髓核细胞能够产生 lncRNA 和 mRNA 差异表达，概述了基因表达调控模式。这些研究成果进一步提供了更有价值的信息，以便人们能够更好地了解在干细胞疗法和 IDD 治疗中的生物标志物。

在前期细胞实验的基础上，各研究团队逐步开始 ADMSC 的动物实验及临床应用。Hua 等[24]研究表明，Smoothened 激动剂 ( smoothened agonist，SAG ) 能够有效地活化音猬因子 ( sonichedgehog，Shh ) 信号通路，促进 ADSC 的髓核细胞样分化；该研究团队使用 SAG 和 TGF-β3 处理后的 ADMSC 进行实验，其结果表明两者组合能够增加 ADMSC 的 ECM 合成、髓核细胞特异性标志基因和蛋白产物的表达水平增加，与此同时，体内椎间盘的高度、含水量、ECM 含量也获得明显改善。Ishiguro等[25]使用 ADMSC 成功制备了一种无支架组织工程结构 ( tissue-engineered construct，TEC )，并将其应用在切除了全部髓核的大鼠椎间盘退变模型中，植入后 6 个月对其进行评估，结果表明 ADMSC-TEC 的植入不仅能维持椎间盘的高度、保留纤维环和软骨终板的结构，植入后第 6 周就显现出与假手术组类似的生物力学特征；更重要的是，这种由 ADMSC-TEC 再生的椎间盘与正常大鼠的椎间盘相比，不易随年龄的增长而发生退变。这为 ADMSC 的临床应用提供了一定的理论基础，且 SAG 的促分化作用的发现拓宽了 ADMSC 的使用方式。Kumar 等[26]在临床治疗中验证了 ADMSC 用于慢性盘源性下腰痛的安全性和耐受性，提示 ADMSC 可能可以用于 DDD 的临床治疗；该研究团队在 10 例的退变椎间盘内植入透明质酸与 ADMSC 混合物，之后对所有患者进行了为期 1 年的跟踪随访，6 例的 VAS 由 ( 6.50±1.27 ) 分降至 ( 2.90±1.66 ) 分、ODI 由 42.80±15.03 降至 16.80±9.77，MRI 结果表明 3 例的椎间盘含水量明显提升，全部患者未有不良事件发生。

当前研究表明 ADMSC 在一定条件下可以成功诱导分化为髓核样细胞，从而对退变椎间盘进行修复，且部分生物因子能够增强 ADMSC 的修复作用；动物模型及临床试验表明 ADMSC 可以改善退变椎间盘的生理状态、缓解临床症状；同时，ADSMC 因其来源广泛、易于获得等特点受到人们的广泛关注，具有光明的应用前景。但同样的，ADMSC 的临床试验的长期有效性及安全性仍需进一步接受验证，以便更好地开展相关临床应用。

3. 脐带间充质干细胞 ( umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC )：UCMSC 主要存在于脐带华通胶组织中，2003 年，K.E.Mitchell 首次在该组织中分离出 UCMSC，因此来自该处的 UCMSC 又被称为华通胶间质干细胞 ( Wharton's Jelly derived mesenchymal stem cell，WJMSC )。

Wang 等[27]研究表明，WJMSC 的基因表达模式与 ADMSC 相似，炎性刺激可调节 WJMSC 的基因表达，在人胎儿 MSC 共培养体系中显示出免疫抑制效应。Beeravolu 等[28]研究了 WJMSC 和该细胞体外诱导分化的软骨祖细胞 ( chondroprogenitor cells，CPC ) 在家兔 IDD 模型中的相关应用，其结果表明移植后的干细胞在受损椎间盘内能够良好的存活并均匀的分散在髓核内；同时，与 WJMSC 相比，CPC 在体外培养时，其细胞结构、细胞外基质蛋白、糖胺聚糖含量均有明显改善，在接受了 CPC 移植的椎间盘内，其髓核特异性标记物含量也明显升高，显现出强大的修复能力。Pang 等[29]在 2 例患有慢性盘源性下腰痛患者的病变椎间盘内注入 WJMSC 治疗，2 年的跟踪随访结果显示，2 例 VAS、ODI 均明显降低。

WJMSC 可以在体外诱导分化成为 CPC 再进行移植，且修复效果要优于 WJMSC 的直接应用，一定程度上能够避免干细胞多向分化性在移植后可能带来的不利后果，这也为其它来源干细胞的发展应用提供了新启示。尽管 WJMSC 具有其它 MSC 的相同生物特性，与其它类型的 MSC 相比并不具备明显优势，因此缺乏对于 WJMSC 对 DDD 的临床治疗以及基础实验的研究报道，高昂的实验成本也成为了 UCMSC 发展的另一项阻碍。但相关实验结果初步说明了 WJMSC 在临床的实际应用中可能是可行的，为 WJMSC 的临床应用打下了基础；目前的研究对象主要是自体 WJMSC，有待进一步对于异体 WJMSC 移植的修复效果及生物安全性进行准确的评价。

三、椎间盘源性干细胞

MSC 的相关研究进展已取得巨大成果，但是 MSC 移植疗法在临床应用还较为有限：治疗过程中需要通过有创操作对干细胞进行获取和移植，有可能发生移植靶点的渗漏或者骨赘的形成等临床并发症。既往研究表明，椎间盘髓核组织、纤维环、软骨终板中均存在有一定数量的 MSC[30]；IVDSC 不仅具有干细胞的成长、分化特性，其椎间盘来源特征在退变椎间盘组织再生的修复治疗策略显现了巨大的潜力。

Wang 等[31]对 BMSC、软骨终板源性干细胞 ( cartilage endplate-derived stem cells，CESC )、髓核源性干细胞 ( nucleus puplposus-derived stem cells，NPSC )、纤维环源性干细胞 ( annulus fibrosus-derived stem cells，AFSC ) 的增殖能力进行了比较，四种细胞之间无统计学差异，但体外细胞分化实验表明，CESC 在成软骨及成骨能力方面要优于其它三种细胞。He 等[32]研究表明，CESC 不仅能够促进软骨终板的修复，还可通过旁分泌途径促进髓核细胞的增殖。髓核组织内的干细胞还能够沿着椎间盘内的纤维和细胞方向进行迁移[33]。另有研究发现，低氧环境能够促进髓核间质干细胞增殖，其机制可能与 SIRT1 及 SIRT6 介导的 HIF-1α 信号通路有关；辛伐他汀可以通过促进缺氧诱导因子的表达来促进髓核实质干细胞向髓核细胞的分化，从而修复和重建退化的椎间盘[34-35]。

动物实验方面，Chen 等[36]在家兔 IDD 模型中比较了髓核间充质干细胞与髓核细胞移植的治疗效果，MRI 提示前者修复效果明显优于后者。目前为止，CESC 应用仍面临着巨大挑战：CESC 特异性表型尚未明确，从软骨终板中分离出 CESC 的效率较低，限制了 CESC 的应用[29]；特异性的诱导 CESC 分化成为透明软骨组织而不是骨组织也存在一定难度[37]。

椎间盘的微环境的特征是低氧、高压力、高渗、低 pH 值和营养供应不足[38]。Yasen 等[39]研究表明，随着 IDD 的发生，IVDSC 也会发生老化和变性。尚未有研究清楚地表明如何避免 IVDSC 受老化、恶劣椎间盘微环境的影响，这些不利因素对植入的或内源性干细胞的存活和功能提出了严峻的挑战，可能导致内源性修复的失败。

四、多能干细胞

包括诱导多能干细胞 ( induced pluripotent stem cell，IPSC )、胚胎干细胞 ( embryonic stem cell，ESC ) 在内的 PSC 在退变椎间盘的修复中也显现了巨大潜力。IPSC 是体细胞通过导入多能遗传基因诱导分化而来的一类具有多分化潜能的干细胞。

Hu 等[40]研究了载有 GDF5 转染人类诱导多能干细胞 ( GDF5-hiPSC ) 的热敏水凝胶对大鼠 IDD 模型的影响；GDF5-hiPSC 与大鼠 NPC 在体外共培养后 3 种软骨细胞标志物 ( SOX9、COL2、蛋白聚糖 ) 的 mRNA 表达显著增高，说明其成功分化为软骨细胞表型；将制备好的水凝胶植入大鼠 IDD 模型中，分别在第 1、2、3 个月进行 X 线、MRI 以及组织学评估，其结果表明载有 GDF5-hiPSC 的热敏凝胶能够有效地改善 IDD。Liu 等[41]的研究发现，髓核细胞外基质能够诱导 IPSC 分化为类髓核样细胞，这表明髓核细胞能够分泌一些调控因子对干细胞进行诱导，进而修复退变椎间盘组织。这些研究为 IPSC 的临床应用奠定了一定的基础。Sheikh 等[42]将小鼠 ESC 衍生的软骨细胞祖细胞在移植到家兔退变椎间盘内，成功产生脊索细胞 ( notochordal cells，NC ) 群。而 NC 是椎间盘再生的关键细胞，NC 能够产生蛋白聚糖促进退变椎间盘的修复[43]。

尽管 IPSC 同样能够产生髓核细胞表型、能够促进退变椎间盘修复，为其临床应用奠定了一定的基础。但是 IPSC 具有肿瘤增殖细胞分化特性，ESC 在体外的定向分化存在不稳定性、在体内具有致瘤性[44]以及与其相关的道德和法律问题限制了这两种细胞的进一步应用。因此需要进一步的实验研究来稳定 PSC 的分化表达，以确保临床应用的有效性和安全性。

五、干细胞植入载体的发展

干细胞移植的应用中，不仅移植细胞的生长和分化不良影响其治疗效果，其植入部位干细胞渗漏这一问题同样阻碍着该方法的发展。多个研究团队针对这一系列问题，研究并制备了用于干细胞移植的各种生物材料。

McKee 等[45]研制了一种由丙烯酸和巯基官能化的自组装聚乙二醇 ( polyethylene glycol，PEG ) 水凝胶支架，然后将人脐带来源的 MSC 与家兔退变髓核细胞载入该支架内后，分别进行了家兔 IDD 模型的体内、外实验；其结果表明该支架的应用不仅能够促进 MSC 产生髓核细胞样表型，而且硫酸化的糖胺聚糖水平要高于未使用支架的实验组，更重要的是：支架的应用能够保证移植细胞在椎间盘内的稳定存在，避免发生细胞泄漏，促进了移植干细胞的修复效果。Nair 等[46]使用壳聚糖-聚羟基丁酸酯-共-戊酸酯 [ chitosan-poly ( hydroxybutyrate-co-valerate )，CP ] 和硫酸软骨素 ( chondroitin sulfate，CS ) 制备了一种可以附载 MSC 的水凝胶纳米微粒，与常规水凝胶相比，该复合水凝胶不需要使用交联剂，且在吸水率与生物力学方面与天然组织相似，提高了其生物相容性；与不含 CS 的水凝胶相比，该复合水凝胶与大鼠来源的 ADMSC 复合培养表现出更强的促分化能力，ADMSC 的细胞活力与软骨分化能力明显提升。Chen 等[47]在光交联明胶-透明质酸甲基丙烯酸酯 ( gelatin-hyaluronic acid methacrylate，GelHA ) 水凝胶上载入 ADMSC 后培养分化，并将复合水凝胶植入大鼠退变模型的椎间盘内；实验结果表明，光交联的 GelHA 水凝胶能够通过刺激活化整合素 αVβ6-TGF-β1 通路进而促进 ADMSC 的髓核细胞样分化、促进退变椎间盘的自我修复。

生物复合材料一方面能够提供适合干细胞生长的三维结构，另一方面可以与某些能够促进干细胞髓核样分化和表达的生物因子或药物巧妙地结合起来；如此一来，不仅能够促进 MSC 的髓核细胞表型、促进细胞外基质的分泌，加速对退变椎间盘的修复，而且在一定程度上克服 MSC 的成脂化和成骨化倾向，稳定 MSC 的分化；同时 ECM 逐步替代被吸收的水凝胶等可吸收生物材料，降低了 MSC 植入后的流失对治疗效果的影响。随着各类实验研究的开展，载体材料的生物相容性逐步提升、新的生物材料逐步出现，应为干细胞疗法在 DDD 的应用中提供了更广阔的空间。

当前，初步的细胞实验、动物模型实验以及临床研究证明了干细胞治疗 DDD 的光明前景。在对不同来源的干细胞进行研究过程中，各类具有诱导分化、促进表达作用的生物因子的发现；干细胞与靶细胞作用机制的进一步阐明；同种异体干细胞以及 IVDSC 的应用；干细胞载体的发展不仅提高了干细胞对退变椎间盘的修复能力，也正逐步拓宽了干细胞治疗退变性椎间盘的适应证，同时丰富了干细胞的来源，为干细胞移植修复退变椎间盘及其临床应用打下了坚实的基础。总的来说，虽然干细胞当前的临床应用中没有出现严重的安全问题且临床效果明显，但是大部分实验研究集中在临床前阶段，所以需要进一步的对照研究、纳入更多的临床病例、进行长时间的跟踪随访来进一步验证其疗效与安全性。

鉴于干细胞在 DDD 的治疗中展现的巨大潜力，结合当前研究的实验成果与不足，未来需进一步阐明干细胞的修复机制及其与靶细胞之间的相互作用，以期发现更多促分化的“靶点”；研究如何改善退变椎间盘内的恶劣微环境，以便为载入的干细胞提供良好的生长空间；探索如何才能高效、稳定地对不同来源的干细胞进行诱导分化，提高干细胞的生物安全性；继续优化干细胞植入载体的材料性能，增强干细胞的修复能力，避免植入过程的“二次伤害”，提高干细胞治疗的临床疗效。总之，作为对 DDD 一种新的治疗办法，干细胞治疗及相关技术在未来前途一片光明。