HBV持续感染及其机制的研究进展

陈 欢，杨燕卿，储 君，张国远，林世德

遵义医科大学附属医院 感染科，贵州 遵义 563003

根据2016年全球疾病负担研究报告，每年高达80万患者死于HBV感染和其所致的终末期肝病(肝硬化、肝衰竭、肝癌等)[1-2]。目前批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物包括干扰素和核苷(酸)类似物。由于干扰素治疗的副作用，只有一小部分慢性乙型肝炎符合其使用指征，且疗效有限，干扰素治疗后不到10%的患者能实现持续HBsAg阴转[2-3]。核苷(酸)类似物治疗的耐受性较好，可以明显降低HBV载量，但其对HBsAg血清学转换影响不大，且在停止治疗后存在病毒反弹、肝炎复发、肝衰竭、失代偿，甚至死亡的风险，故大多数患者需要长期口服抗病毒药物维持治疗[4-5]。经治疗后达到病毒抑制或已治愈的急性或慢性乙型肝炎患者，在接受免疫抑制治疗或免疫力低下的情况下，HBV可发生再活化，这表明该病毒并没有彻底被消灭[3]。基于这一现状，迫切需要认识HBV持续感染的机制，以实现慢性乙型肝炎治疗上的突破。

HBV属嗜肝DNA病毒科，大小约3.2 kb，其感染肝细胞后，在细胞核内释放松弛环状DNA(relax circular DNA，rcDNA)，rcDNA经过某种修复机制，修复正链转变成共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)[5]。细胞RNA聚合酶Ⅱ以cccDNA 负链(包含4个开放读码框，即S、C、P、X区)为模板，转录产生4种mRNA，大小分别为3.5、2.4、2.1和0.7 kb，其中3.5 kb mRNA又称为前基因组RNA(pregenome RNA，pgRNA)。mRNAs从细胞核移至细胞质，翻译成HBcAg、HBeAg、病毒DNA聚合酶、HBsAg、HBx蛋白，也可组装形成成熟的病毒衣壳。成熟的病毒衣壳可经过包膜蛋白包裹，以病毒颗粒的形式分泌到细胞外，也可再次进入细胞核以补充或扩增cccDNA池[4-5]。这些HBV病毒组分、病毒颗粒及cccDNA是HBV生命周期中的产物，可作用于自身，同时又可与宿主相互作用，促进HBV的复制，负向调节免疫功能，引起HBV慢性感染，促进疾病的进展。下面将阐述cccDNA、HBV颗粒及病毒蛋白成分维持HBV持续感染的相关研究进展。

1 cccDNA与HBV持续感染

cccDNA是HBV复制周期的一个关键复制中间体，在细胞核内与细胞组蛋白和非组蛋白形成一个微型染色体。它不包含复制起点，不能在受感染的肝细胞中自我复制。理论上cccDNA应随着细胞分裂而丢失，然而，尽管诱导细胞分裂后cccDNA显著减少，但通过cccDNA的不断补充，及其在细胞核中的稳定性，使cccDNA在细胞核中仍持续存在[6]。到目前为止，已经确定了3种补充cccDNA的途径：病毒颗粒通过与肝细胞上的钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白受体结合，感染肝细胞，这是cccDNA生成的典型途径；第2条途径是细胞质中HBcAg的富精氨酸碳端域触发含rcDNA的衣壳进入细胞核，rcDNA通过细胞内途径转化为cccDNA；第3条途径是肝细胞内的cccDNA孵育活化，这是HBV复发的主要因素[7]。Ko等[8]也再次证实HBV基因组的细胞内循环以及病毒粒子感染细胞促进了cccDNA的形成。cccDNA在细胞核中的稳定性可能与泛素结合酶E2L3诱导载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A的蛋白酶体依赖性降解有关[9]，同时也可能与HBx蛋白稳定cccDNA的核定位有关[10]。由此可见HBV持续感染与cccDNA的不断补充及其在细胞核中的稳定存在密切关系。

cccDNA的转录活动受到宿主细胞转录因子调控[7]，Zhang等[11]发现类视黄醇X受体α可直接与cccDNA结合，促进HBV复制，其潜在机制可能与促进cccDNA对乙酰转移酶p300的招募有关；也有研究[12]发现肝细胞核因子可通过与cccDNA结合，促进其转录活动。另外，cccDNA结合组蛋白表观遗传修饰也可调控cccDNA转录，如cccDNA结合组蛋白乙酰化可使染色质结构松弛，从而激活转录活性，而去乙酰化则诱导染色质处于浓缩或非活性状态[13]。除此之外，cccDNA转录活动也与HBx及HBcAg关系密切，如HBx蛋白与DNA损伤特异性结合蛋白1相互作用，通过降解Smc5/6蛋白，促进HBV转录[14]； Kinoshita等[15]也发现前体mRNA加工因子31与细胞核内的HBx相互作用，并通过HBx增强了cccDNA的形成；HBcAg的富精氨酸碳端域对HBV转录以及随后的复制步骤起重要作用，可能与减少HBcAg与cccDNA的相互作用和减少与cccDNA结合的组蛋白乙酰化有关[16]。cccDNA的转录活动受到诸多因子调控，此处没有一一罗列，而这些因子使cccDNA在细胞核持续存在，鉴于目前没有靶向清除cccDNA的抗病毒药物，这就使得彻底治愈慢性乙型肝炎变得异常艰难。

2 HBV颗粒与HBV持续感染

HBV颗粒包含HBV DNA颗粒、HBV RNA颗粒及亚病毒颗粒。HBV DNA颗粒即Dane颗粒由包膜和核衣壳组成。包膜由表面抗原组成；核衣壳由240个核心蛋白组成，其内包含HBV聚合酶和rcDNA，具有传染性。HBV RNA颗粒与HBV DNA形态类似，两者包膜和核衣壳组分相同，但RNA颗粒的核衣壳内是pgRNA，其是否具有传染性，目前尚不清楚[17]；亚病毒颗粒呈丝状或小球型，22 nm，仅由表面抗原组成，且数量远远超过了Dane颗粒，达10～10 000倍[18]。几种病毒颗粒组成上的不同，使其在HBV持续感染中发挥不同的作用。

过量的亚病毒颗粒可作为HBV特异性体液免疫的诱饵，持续触发抗原特异性T淋巴细胞受体信号通路而导致病毒特异性T淋巴细胞的衰竭；亚病毒颗粒也可以负调节先天免疫信号通路,如通过干扰c-Jun 氨基末端激酶激活，选择性抑制Toll样受体2配体，使单核细胞、巨噬细胞下调IL-12的表达[3,19]，这促进了HBV感染的慢性化。

pgRNA作为新的肝内HBV复制和治疗反应的标志物，一项动物实验[20]表明，在未抗病毒治疗以前，血清中的pgRNA与肝细胞内的cccDNA显著相关(r=0.89，P<0.000 1)，但治疗以后，两者无相关关系(r=0.13，P=0.733)，此项结果提示在未抗病毒治疗以前，pgRNA可较准确反映HBV在体内复制情况。也有研究[17]表明在首次治疗的慢性乙型肝炎患者血清中，HBV pgRNA颗粒显著低于HBV DNA颗粒(P=0.007)，但给予核苷(酸)类似物抗病毒治疗后，HBV pgRNA/HBV DNA显著升高(P<0.000 1)，这可能与核苷(酸)类似物抑制HBV pgRNA逆转录有关。在停用核苷(酸)类似物抗病毒治疗时，患者血清中若能检测到HBV pgRNA颗粒，其在停药后24周发生病毒反弹概率为100%。提示HBV pgRNA可能与HBV的持续感染和病毒反弹存在联系。

3 HBV蛋白与HBV持续感染

3.1 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) HBV表达3个包膜蛋白，即小蛋白、中蛋白、大蛋白[21]。小蛋白含226个氨基酸，即HBsAg；中蛋白在小蛋白基础上有一个额外的Pre-S2结构域，Pre-S2含55个氨基酸，其中包含人多聚白蛋白受体，HBV可通过多聚白蛋白受体与肝细胞间接结合，参与HBV感染肝细胞[22]；大蛋白在中蛋白基础上有一个额外的Pre-S1结构域，Pre-S1含108或119个氨基酸，据不同基因型而定，其中第21～47位氨基酸残基是肝细胞HBV受体的配体，对HBV感染肝细胞至关重要[23]。

HBsAg是HBV分泌到血清中的主要病毒蛋白，其定量价值是评价慢性HBV感染和抗病毒反应的重要标志。有研究[24]发现HBsAg中一些氨基酸替换可能损害病毒粒子的分泌，改变HBsAg与抗体结合的能力，或影响HBV复制，使得血清HBsAg、HBV DNA检测水平下降；同样，在宿主HBV免疫清除过程中，可能会诱导HBV Pre-S基因的许多位点发生突变，这些突变可能与HBV复制缺陷有关，可能是HBV发生免疫逃逸、隐匿性HBV感染的原因之一[23]。Bi等[21]也发现免疫突变株如N146Q、G145R等可使包膜蛋白S域的N端糖基化受损，从而影响病毒颗粒的分泌，且这些突变株可降低突变包膜蛋白对HBV抗体的亲和力，从而导致诊断失败、HBV隐匿性感染或疫苗接种失败。此外，HBV S基因可整合到宿主启动子序列和启动子侧翼调控序列中(整合位点：3q26、10q23、10q22、15p11.1、3p13、12q13)，通过宿主启动子转录HBsAg，并从肝细胞释放到外周血中，导致血清中HBsAg持续存在，甚至有时维持在较高水平[25]。而外周循环中的高水平HBsAg可引起树突状细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞功能受损，诱导宿主免疫耐受，从而导致HBV持续感染[26]。

3.2 乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg) HBcAg是一种结构蛋白，分子量为21 kD，包含183个氨基酸，前149个残基组成N端域，对衣壳组装至关重要；其余34个残基形成一个富含精氨酸的C端域，与核酸结合，并发出核定位和输出信号[27]。HBcAg在病毒复制中发挥着多种重要作用，包括衣壳组装、pgRNA包装、病毒逆转录以及病毒粒子分泌。MxA蛋白可抑制HBV mRNA的核质转运以及在不影响HBcAg的情况下抑制HBsAg和HBV DNA产生[28]，而Fernandez等[29]研究发现HBcAg可与MxA启动子相互作用而显著下调MxA蛋白表达以影响其抗病毒作用。有研究[30]发现HBcAg可显著抑制人类死亡受体5基因的启动子活性，下调人类死亡受体5蛋白表达，使感染HBV的肝细胞对TNF相关的凋亡诱导配体诱导的凋亡不敏感，从而在慢性感染中发挥作用。树突状细胞是最有效的抗原呈递细胞类型，具有独特的能力，不仅能诱导对入侵病原体的初级免疫反应，还具有免疫耐受作用。Li等[31]发现HBcAg通过激活PI3K/AKT、ERK和P38信号通路，诱导树突状细胞上调CD274(又称程序性死亡配体1或B7-H1)表达，促进树突状细胞凋亡，抑制HBV DNA的清除。而树突状细胞的减少有助于免疫耐受，这也可能是HBV持续感染的潜在机制之一。然而，也有报道[32]称HBcAg通过PKC/NF-κB/bcl-2信号通路，促进DC2.4小鼠树突状细胞增殖和抑制其凋亡。鉴于HBcAg对免疫系统作用的复杂，更加深层次、全面的机制仍需进一步探讨。

3.3 乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg) Pre-C基因和C基因共同编码HBeAg的前体，HBeAg前体通过蛋白水解过程去除氨基端的19个氨基酸残基、羧基端的34个氨基酸疏水多肽，即形成HBeAg，有159个氨基酸残基，分子量为18 kD[33]。HBeAg作为一种具有重要免疫调节作用的非结构性病毒蛋白，参与调节先天、适应性免疫反应和维持HBV的持续感染[34]。Lu等[35]发现HBeAg可以抑制组织细胞淋巴瘤细胞(U937细胞)的迁移，促进细胞因子产生，包括B淋巴细胞激活因子、IL-6和IL-10；HBeAg还可通过直接诱导方式促进人B淋巴母细胞活化和增殖。这些结果提示HBeAg在调节单核细胞功能和促进B淋巴细胞活化方面发挥一定作用。单核细胞和中性粒细胞的聚集对炎症的发生至关重要，而Leu等[36]发现HBeAg可抑制人单核细胞和中性粒细胞的呼吸爆发和迁移，这可能会干扰随后针对HBV的先天和适应性免疫反应，导致慢性感染的形成。除此之外，也有研究[33]表明HBeAg通过与Toll样受体2、β干扰素TIR结构域衔接蛋白接相关受体分子的相互作用抑制先天性免疫的信号转导；HBeAg可能促进HBeAg特异性和HBcAg特异性1型辅助性T淋巴细胞耗竭，并阻断抗-HBc反应；HBeAg还可阻碍树突状细胞的成熟[37]。上述证据均提示HBeAg对HBV免疫治疗有负作用，有利于维持HBV慢性感染。

3.4 DNA聚合酶 HBV DNA聚合酶(P蛋白)为含有832个氨基酸的多功能蛋白，含有多个功能区，从N端至C端依次为：末端蛋白域、间隔域、逆转录酶和核糖核酸酶域。末端蛋白域为嗜肝病毒所独有的，包含合成负链的起始引物；间隔域是一个在P蛋白内保守性较差的区域，能够承受各种缺失和插入，而不会显著改变P蛋白基因组复制功能，逆转录酶和核糖核酸酶域负责逆转录和降解pgRNA[38]。P蛋白没有3′-5′核酸外切酶活性，缺乏校对能力，病毒基因组复制的错误率高达10-7/个核苷酸，是其他DNA病毒的10倍，易导致突变株的出现。然而用于HBV治疗的药物核苷(酸)类似物都是以P蛋白的DNA聚合酶活性为靶点，这就使得治疗过程中出现的HBV耐药，成了影响长期治疗的一个主要问题。末端蛋白域的8个突变株(rtL80I、rtD134N、rtN139K/T/H、rtY141F、rtM204I/V、rtF221Y、rtI224V及rtM309K)与病情进展显著相关[39-40]。

3.5 HBx蛋白 HBx蛋白是一种非结构蛋白, 含154个氨基酸，分子量为17 kD。X蛋白对病毒复制的启动和维持起着至关重要的作用，当没有X蛋白表达时，几乎检测不到HBV的转录[41]。有研究[12]发现X蛋白在细胞核，通过招募P300/CBP相关因子，P300/CBP等组蛋白修饰物，调节cccDNA、激活HBV转录；在细胞质中刺激代谢、增殖等信号转导通路，以促进病毒复制和转录；部分细胞质的X蛋白定位在线粒体的外膜，并与依赖电压的阴离子通道相互作用，从而改变线粒体的膜电位，这可能与HBV诱导的肝损伤、肝癌的发生有关[14,42]；定位在内质网腔内的X蛋白与葡萄糖调节蛋白78直接作用，导致真核细胞起始因子2α磷酸化的抑制，抑制下游蛋白即活化转录因子4、DNA损害诱导基因153、Bcl-2蛋白表达，下调聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶和γH2AX蛋白水平，使感染HBV的肝细胞逃避内质网应激诱导的凋亡[43]。Jessica等[44]首次提出X蛋白可调节人类原代肝细胞内的Ca2+信号，并作为上游信号启动X蛋白的其他效应，包括X蛋白调节细胞周期蛋白、刺激病毒复制。HBx作为HBV复制和HBV相关肝细胞癌变的重要辅激活剂，可以增强FoxA1与MSL2启动子区结合的能力，上调的MSL2蛋白可通过泛素化APOBEC3B使其降解，来维持HBV cccDNA的稳定性，形成HBx/MSL2/cccDNA/HBV的正反馈回路，促进肝癌的发生[45]。而持续稳定的cccDNA水平与细胞内HBV基因再循环和继发感染关系密切[8]。

4 小结

HBV可通过自身病毒成分之间的相互作用以及与宿主发生相互作用，维持cccDNA在细胞核的稳定性，促进HBV的复制，负向调节免疫功能，建立HBV慢性感染；HBV也可发生突变，产生免疫逃逸株、耐药株等，降低对抗病毒药物的敏感性。这些方面的因素均使得治愈乙型肝炎变得困难。幸运的是，一系列针对HBV持续感染药物，从干扰和破坏病毒RNA、干扰病毒DNA蛋白合成、干扰HBsAg产生、激活人体免疫系统等方面都有了新的进展。希望能早日通过药物试验，尽早实现乙型肝炎的彻底治愈。