多囊卵巢综合征与生物钟的研究进展

邹怡欣，时雨杰 综 述，刘 煜，刘 畅 审 校

（1.中国药科大学生命科学与技术学院，南京211198；2.南京医科大学附属逸夫医院，南京211166）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）是一种常见的内分泌异常导致的排卵功能障碍性疾病。据估计，约1/5 的育龄妇女受其影响[1-2]。该病症在临床上的表现为：(1)在生殖方面，常表现为稀发排卵或无排卵、不孕、雄激素过多和多毛；(2)在代谢方面，显示出胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）、葡萄糖耐量降低、2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM） 以及心血管疾病（cardiovascular diseases,CVDs）多发等症状；(3)在心理上则表现为焦虑、抑郁[3]。因持续无排卵，在严重情况下PCOS 还会使子宫内膜过度增生，增加子宫内膜癌的风险[4-5]。此外，PCOS 对其他系统也有影响，如还能引发口腔病症[6]。

一般认为，由PCOS 导致的激素失调主要表现为胰岛素和雄激素水平升高。同时，遗传、环境与其他因素相结合导致内分泌紊乱[7]。生殖神经内分泌功能障碍使促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone, GnRH）、促黄体激素（luteinizing hormone, LH）的分泌频率和幅度增加，是PCOS 的病理生理机制之一[8]。有研究证明，肥胖、卵巢功能不全和下丘脑垂体轴各水平的功能紊乱也是促成PCOS 的原因。PCOS 患者易发肥胖；反之，肥胖同样可导致PCOS 的发生[9]。肥胖诱发的代谢紊乱不仅可增加罹患高雄激素血症（hyperandrogenemia,HA）、多毛症、不育症和妊娠期并发症的风险，还能协同IR 进一步加剧T2DM 和心血管疾病的发生。此外，PCOS 伴随肥胖症还可以使IR 恶化，增加CVDs 的患病率[10]。

1 生物钟和女性生殖功能的关系

在自然界中，从单细胞到高等生物，乃至人类的几乎所有生命活动均存在着按照一定规律进行的周期性现象，这种生命活动现象称为生物钟[11]。以哺乳动物为例，生物钟控制着各种生理进程，如睡眠周期、血压、血液激素水平及能量代谢等，使之呈现出大约以24 h 为周期的节律性变化。由于生物钟的存在，从细胞到器官乃至个体在不同时期，对外界环境的各种理化因子表现出反应性和敏感性的差异。

生物钟基因在细胞和分子水平上与哺乳动物的生殖生理和生殖内分泌密切相关，流行病学研究表明生物钟失调的女性更易表现出生殖力低下和不良妊娠的特征。目前人们对生物钟如何影响生殖的机制尚不清楚，钟基因的表达与PCOS 临床病理学特征之间的分子机制也未完全阐明。因此，深入研究生物钟紊乱与PCOS 发病机制的关联，可以在临床中更好地运用时间生物学原理为治疗PCOS 服务[12-13]，实现个性化精准医疗。

1.1 生物钟及其分子机制 昼夜节律由一系列钟基因的转录和转录后调控产生的分子振荡引起，机体内不同水平的生命活动均表现出一定的时间顺序性及周期节律性[14]。生物钟以位于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）的中枢振荡器为主起搏点，其他外周组织为次起搏点。中枢和外周生物钟共同构成一个完整的调节系统，产生并维持以24 h 为一个循环周期的昼夜波动[15-16]。生物钟依赖于钟基因“转录-翻译-加工”的自我调节反馈环路，对其表达和各种生理活动进行调控。核心反馈调节环路如下：核心转录因子BMAL1 (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like, Arntl)与CLOCK (circadian locomotor output kaput)相互结合形成异源二聚体，随后在转录水平上调控其他钟基因的表达，例如PER 1/2/3（Period 1/2/3）和CRY 1/2（cryptochrome 1/2）。转录结束后，PER 和CRY 在细胞质内进入翻译阶段，当胞质内二者蛋白水平达到一定浓度阈值时，则重新转位至细胞核，抑制CLOCK/BMAL1 二聚体的转录活性，同时PER 和CRY 的转录活性也被抑制，由此形成反馈调节[17]。除核心反馈调节环路以外，CLOCK/BMAL1 异源二聚体还可以诱导核受体（nuclear hormone receptors,NHRs）的调节，如RORs（retinoic-acid-receptorrelated orphan receptors, RORɑ/β）和NR1D1/REVERBs (nuclear receptor subfamily 1, group D,member)，二者分别激活和抑制BMAL1 的转录[18-19]。

1.2 卵巢生物钟的调控作用 研究表明，约43%的基因在外周组织中呈现出节律性表达，包括肝脏、心脏、骨骼肌和卵巢[20]。由此可见，除了由SCN 调控的主生物钟外，各外周器官也存在相应的外周生物钟。外周时钟节律与能量稳态之间存在直接关系，且时钟基因的表达与代谢基因的转录活性是可调控的[21]。例如，Kobayashi 等[22]研究发现，胃动脉中雌二醇（17β-estradiol,E2）水平表现出明显的昼夜节律，且与胃门静脉E2 水平呈现正相关，与肝脏中Esr1(estrogen receptor ɑ, ERɑ mRNA)的基因表达呈现负相关。由此可以得出结论，血液E2 水平的昼夜节律受控于胃门静脉E2 的量和肝脏中ESR1 的表达。

卵巢生物钟在中枢生物钟的调控下影响排卵并控制类固醇激素的释放。PER1、PER2 和BMAL1等时钟基因在大鼠卵巢中的表达具有昼夜节律性，进而调节卵泡和黄体内颗粒细胞和卵泡膜细胞的生理活动。Fahrenkrug 等[23]利用RT-PCR 和免疫组学等技术发现，雌鼠卵巢细胞内生物钟基因Per1 和Per2 表达具有明显的昼夜周期性，该研究证明了卵巢生物钟的存在。同样，Karman 等[24]通过RT-PCR技术发现核心振荡器元件（Clock、Bmal1、Cry1、Per1、Per2 等核心生物钟基因）在卵巢中节律性表达，为发现卵巢中昼夜节律转录翻译反馈环路奠定了基础。

另外，在下丘脑-垂体-卵巢（hypothalamuspituitary-ovary,HPO）轴的各个水平上均存在生物钟，而生物钟的失调，正是导致各种生殖疾病的原因。由此可以认为，PCOS 是由于中枢时钟和HPO轴上各时钟不同步导致的。张芹等[25]选取了雌性Rev-erb-α 敲除型（Rev-erb-α-/-）和野生型（Reverb-α+/+）小鼠，分别与雄性野生型C57BL/6J 小鼠交配观察雌鼠的生理周期，发现敲除型小鼠生理周期延长导致其生殖能力下降，表明生物节律在维持生理周期稳态上扮演着重要角色。马广军等[26]的研究表明，持续光照会降低卵巢雌激素的合成与分泌，并且卵巢颗粒细胞内瘦素受体（leptin receptor,Lepr）的表达受BMAL1 的正向调控，光照周期紊乱会破坏生物钟系统的稳定，抑制Lepr 的mRNA 表达从而阻断瘦素对E2 合成的调控作用。Shimizu 等[27]研究发现，昼夜节律基因还与雌性动物的发情周期有关，Per2 和Clock 时钟基因均能调节卵巢颗粒细胞的功能，PER2 能够通过刺激E2 的产生和P450的表达增加颗粒细胞黄体酮的生成，而CLOCK 则与PER2 有着相反的调控作用。

主生物钟主要受光暗周期的调节。SCN 对光线高度敏感，可以接收由视网膜传入的明暗光线的神经冲动，将其转化为化学信号，从而调节褪黑素（melatonin,MT）的分泌。MT 随着光暗的变化呈现昼低夜高的节律，与MT 受体结合引起以24 h 为周期的近日节律的变化。值得注意的是，MT 受体在子宫肌层、卵巢颗粒细胞和黄体细胞[28-29]中均有分布，由此可见，MT 对HPO 轴具有重要的调节作用，主要体现在MT 能促进黄体期卵巢颗粒细胞和黄体细胞中孕酮的合成分泌[30-31]。诸多研究表明，MT 浓度可以影响排卵：经常口服避孕药的女性群体中，MT 水平在黄体中期和中卵泡期相较于正常群体均明显偏高，证明在无排卵月经周期内MT 水平是上升的[32]。下丘脑性闭经患者MT 的昼夜水平均明显高于正常人群，且夜间水平约为正常水平的3 倍[33]。总之，生物钟的紊乱，会引发MT 合成分泌异常，进而影响性激素的合成，直接导致月经周期异常及生殖系统疾病的发生。

1.3 生物钟紊乱与生殖系统疾病 生物钟对机体的影响人的生理功能正常与否和生物钟密切相关，主要表现在体温、行为模式上。内源性昼夜节律主要调节以24 h 为周期的生理机能，如体温、脉搏、呼吸、血压、激素、酶、血液和组织细胞内的生化反应等，基因功能活动也同样呈节律性。不同的组织振荡器对激素都具有调节作用，昼夜节律的变化影响内分泌信号的产生和下游反应的应答，而内分泌信号存在反馈干扰生理和代谢稳态的机制[34]。研究表明，生物钟基因多态性和环境因素导致的HPO 轴上各水平生物钟失同步，是一些复杂生殖系统疾病的病因之一。

生物钟参与控制生殖过程中的排卵、类固醇激素释放、卵泡发育等生殖生理进程。Alvarez 等[35]的研究指出，Bmal1 基因敲除可导致小鼠不孕不育，且小鼠体内的类固醇合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein, StAR）功能障碍，类固醇激素合成水平降低，最终导致小鼠的生殖能力下降。Hickok 等[36]发现，生物钟基因在人GnRH 神经元中存在节律性表达。Smarr 等[37]的研究表明，雌鼠下丘脑前腹侧室旁核中Per1、Bmal1 表达呈现出节律性振荡，从而调控LH 的周期性合成及分泌。可见，生物钟失调与生殖系统疾病密切相关，研究钟基因与生殖疾病间的作用机制，将有助于为相关疾病的治疗提供更广阔的思路。王朝霞等[38]通过在裸鼠移植瘤肿瘤组织中导入Per2 基因，证明PER2 可以下调凋亡抑制基因Bcl-2，促进凋亡基因Bax 表达，进而诱发肿瘤细胞凋亡，通过抑制卵巢癌的生长转移发挥其抑瘤效果。Hideki 等[39]发现Cry1 和Bmal1 与上皮性卵巢癌的临床病理指标（发病年龄、临床分期、病理类型和分级）存在相关性，这两个基因的表达丰度可以代表肿瘤分期和病理分型。另外，子宫内膜癌的发病进程可能与Cry1、Per1、Per2 的CpG 岛甲基化引起的生物钟紊乱有关。

2 生物钟与PCOS 的关系

时钟基因变异或被人为敲除则会导致昼夜节律变化、HPO 轴上各水平生物钟失同步、激素分泌模式改变等多种生理功能的紊乱，会进一步导致相关疾病的发生。流行病学调查表明，女性由于长期熬夜、倒班工作、跨时区飞行等不健康的生活工作方式，正常的昼夜节律受到光暗和时间的影响，致使生殖能力低下和不良妊娠的概率更高[40]。同时，基于卵巢生物钟在调节女性内分泌代谢中发挥关键性作用这一观点，越来越多的证据显示昼夜节律紊乱导致女性群体患PCOS 的风险增加。

2.1 PCOS 的发作时辰节律性 PER2 在海马体突触可塑性和记忆中发挥重要作用，与神经性疾病阿尔茨海默病密切相关[41-42]。Clock 突变小鼠表现出低胰岛素及高血糖血症[43-44]，与T2DM 及心肌疾病相关[45]。这些研究揭示了生物钟在行为、代谢及认知等相关疾病方面的重要性。心血管疾病、脑血管疾病，心源性猝死多发生在清晨醒后数小时，这些疾病的发作都可能与夜间较低水平的血压在清晨觉醒后迅速上升有关联[46]。因此，了解生物钟对于疾病发生与发作时间的了解具有重大意义。

光照或生物钟的紊乱通过影响MT 的合成分泌，导致月经周期紊乱。而PCOS 患者通常在月经时限性、节律周期性和功能状态性上表现异常：（1）时限异常：有研究发现PCOS 在青春期启动提前[47]并表现为发育亢进，另外还表现为绝经延迟。（2）状态异常：PCOS 是原发卵巢的疾病，卵泡功能异常是PCOS 病变的核心[48]，卵泡数量多，E2 浓度高，易发卵巢过度刺激综合征（ovarianhyperstimulation syndrome, OHSS），即卵巢对促性腺激素的过度应答。（3）节律异常：激素调节下节律性的破坏，如年节律，月节律等[49]。PCOS 患者主要表现为月节律性延长或者消失，月经后期稀发、闭经。PCOS 患者在月经周期的不同时期临床表现均有所不同：在经后期即卵泡期，卵泡发育过程中数目过多，且卵泡仅能发育至2～9 mm，在卵泡发育的早期即停止生长；在经间期临床表现为排卵障碍[50]。在月经周期节律中，各种生理水平不停发生节律性变化，生物钟对于卵泡的发育成熟、排卵起着不可替代的作用。而生物钟的紊乱，会导致一些女性内分泌疾病的发病率显著升高。

2.2 PCOS 的药物时辰治疗 PCOS 是一种以持续性无排卵、HA 或IR 为特征的内分泌紊乱综合征，是无排卵性不孕的重要原因，而促排卵是现今治疗PCOS 的主要措施。在此基础上可以结合生物钟的昼夜节律进行给药，遵循人类疾病发生和人体对药物代谢调节的时间特异性分子机制，进而为不同患者提供最佳的用药时间以及精准化的治疗手段。

关于时辰药理学[51-52]的诸多研究已经证实，药物作用与人体生物钟有着极其密切的内在联系。在不同的作用时辰上，相同剂量的同种药物给药可呈现出差异很大的治疗效果。因此，根据机体对药物的反应节律决定最佳的给药剂量和时间，考虑药物的血药浓度与生物钟的配合不仅可以提高疗效和节省药物，还能将药物的不良反应降到最低限度。李伟等[53]在类风湿性关节炎患者C 反应蛋白（Creactive protein,CRP）的浓度随时间变化且零点前达到峰值的事实基础上，进一步证实了晚间给药的用药效果优于传统的晨间给药。胡洁等[54]基于肺癌患者在6 点到12 点时间段内DNA 合成达到高峰的现象而建立小鼠时辰给药系统，筛选出ZT15（Zeitgebertime 15）是紫杉醇抗肿瘤效果最佳的给药时间。目前已有证据表明，高分子量制剂治疗癌症的给药时间受到昼夜血压波动的影响[55]。对于PCOS而言，相关激素在发情周期存在明显的昼夜节律：血浆皮质醇值早上比下午高2～3 倍，其最大值出现在凌晨4～8 点之间，最小值出现在下午4～8 点之间；LH 高峰值多数发生在上午8 点，而在排卵前最高峰出现于凌晨4 点[56]；MT 浓度在夜间达到高峰，且受到光照的影响。由此可见，POCS 患者的生理特征及激素水平是呈现周期性变化的，不同的给药时间会影响药物的干预效果，依据PCOS 患者相关激素的周期节律确定给药时间，将是时辰治疗学在PCOS 治疗中更深层次的应用。

目前，相关治疗药物（例如达英-35、来曲唑、二甲双胍等）的给药时间对PCOS 疗效差异还没有进一步的研究。现有结果指出，在月经周期的不同时期给药会对治疗效果有影响。张新平等[57]通过观察克罗米芬结合人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin,HCG）治疗PCOS 的研究，分析患者血清胰岛素、胰岛素抵抗指数的变化证明该药在一定时期或药物诱发排卵期间，若能合理得当地掌握时间和药量，可起到类似黄体生成激素的疗效诱发排卵。苏静等[58]通过比较在不同时间应用Gn RH 拮抗剂的方案表明，对于基础LH 较高的PCOS患者，为降低OHSS 的发病率，可以提前使用拮抗剂从而降低血清E2 水平达到减少获卵数的目的；而采取灵活的拮抗剂方案则能够获得较多的卵子。

3 展望

目前的研究还远未揭示PCOS 的病因学基础，对PCOS 发病机制的研究主要集中在肥胖、IR、激素失调等方面。越来越多的证据表明生物钟紊乱是多数生殖疾病的病因之一，但对基于生物钟的PCOS发病进程的研究却鲜有报导。通过创新性地提出了生物钟与PCOS 的关系，拟分析生物钟紊乱导致PCOS 的潜在发病机制并对PCOS 的时辰治疗提出了新的见解与思路。相信随着研究的深入，可以填补这一领域的空缺，从时辰治疗学的角度出发，为PCOS 发病机制及其治疗提供更系统、更完善的理论支持，也有助于在临床中更好地运用生物钟，以期在精准医疗中发挥重要作用。