产前B超、MRI及高通量测序在先天性肾缺如中的应用

钟 强，钱 雯，张競之，林晓静，潘 卫，周遵伦

1贵州医科大学临床医学院，贵州 贵阳 550000；贵州医科大学附属医院2贵州省产前诊断中心，4妇产科，贵州贵阳 550000；3贵州医科大学公共卫生学院，贵州 贵阳 550000

肾缺如（RA）是胎儿肾脏在胚胎发育过程中输尿管芽形成失败或者到达/诱导后肾间充质机制发生障碍，以至于胎儿肾脏形成失败，包括单侧肾缺如（URA）与双侧肾缺如（BRA）[1]。其中，BRA是一种极端的出生缺陷，与生命不相容，新生儿发病率为万分之一至万分之三，其胎儿具有典型的面部特征：突出的内眦赘皮，鼻尖钝或向下弯曲的扁平鼻子，下唇和下巴尖端之间的凹陷异常突出等“波特相”及其他面部异常；而URA的新生儿发病率约为1‰，明显高于BRA，虽能与生命相容，但对其生存质量有一定影响，如蛋白尿、高血压和早期肾功能衰竭等，是新生儿或儿童终末期肾病的重要原因之一[2]。在临床上，我们发现URA患者往往因孤立肾代偿性肥大，从而能够维持人体正常的水和电解质平衡，保持生理状态，以至于在胎儿出生后直至长大成人，大部分通常无明显临床症状，甚至终身不被发现[3]。为了在孕期能更好的对胎儿RA进行产前诊断或并进行必要的干预，使孕妇及胎儿有良好的预后，探讨和寻找更多安全经济的诊断技术已成为了必要条件。

1 胚胎肾脏的正常发育

人类肾脏发育始于妊娠早期，肾脏的发育分为前肾、中肾和后肾3个不同但重叠的阶段，前肾和中肾是短暂的排泄系统，最终在不影响永久性肾系统的情况下消失，后肾在胚胎发育的第5周开始，并最终发育为成熟的功能肾[4]。输尿管芽在妊娠第5周侵入周围的后肾间质，发生分支，建立肾脏的放射状结构和肾单位数。来自输尿管芽分支尖端的信号诱导肾单位的形成，并将后肾间质转化为肾上皮（肾小泡）；相反，后肾间质可释放信号刺激输尿管芽分支。肾小泡最终形成肾小球、近端小管和远端小管。妊娠9～10周时第1个肾小球形成[5]。在妊娠12～14周，后肾和输尿管芽分支的早期穿透以形成肾盂，后肾开始功能化，并在妊娠第20周时，输尿管芽分枝成15代并形成整个集合管系统，完成胚胎肾脏发育的30%[1]。直至第34～36周肾单位发育完成，形成最终的成熟肾脏[6]。上皮结构输尿管芽侵袭后肾间充质组织相互诱导相互作用是胚胎肾脏正常发育的关键阶段[7]。

2 产前B超

产前B超利用高频声音脉冲产生图像[8]，是产前诊断胎儿结构异常的主要影像学技术。在妊娠中期进行B超扫描能检测到大多数的肾脏结构异常，最早在妊娠9周时就可以看到胎儿肾脏是否发育正常[9]。在妊娠9～12周，胎儿正常发育肾脏呈小叶状，可以在产前超声影像中椎旁区域发现；15～20周间发生皮质髓质分化，到20周时，具有低回声，髓质暗肾锥体的回声皮质应明显[5]。若胎儿肾脏发育异常，产前B超可以较为准确的进行识别[10]。产前超声技术的改进，正使其逐渐成为出生缺陷产前诊断的常规程序，在一项对298例儿童进行了通过产前B超的选择性畸形诊断中，95例（30.3%）在产前被诊断。畸形检出率为：中枢神经系统异常（68.6%）、胃肠道异常（42.3%）、泌尿系统异常（24.1%）、心脏异常（5.9%）[11]。另一项通过相关产前诊断技术对先天性肾和尿路畸形的流行病学研究中，RA在所有畸形胎儿中的诊断率高达18.96%（529/2790）[12]。目前，RA的诊断没有统一的标准，但通过B超影像学中的一些表现，结合临床信息，可以帮助诊断胎儿是否为RA。在妊娠16周后，产前B超提示胎儿肾窝中没有肾脏、膀胱空虚以及羊水过少则是诊断BRA的有力指标，并且因为肾动脉在后冠状位应视为腹主动脉的直接分支，略低于肠系膜动脉的起点，所以B超下肾动脉的缺失也高度提示BRA[9]。伴随着超声技术的飞速发展，胎儿RA诊断的准确性越来越高。Bronshtein等[13]在妊娠14～18周通过对21例包括有URA等轻微肾脏异常的胎儿经阴道超声检查确诊了9例（43%）URA，并在胎儿出生后或者尸检检查时确诊。另有学者认为在第16周和第20周之间对每位孕妇进行常规超声检查可以避免漏诊或误诊BRA[14]。产前超声技术对于胎儿RA的诊断价值显而易见，相对安全且经济，容易让孕妇及家属接受，建议妊娠孕妇在妊娠中晚期定期行超声检测胎儿是否有RA。但是产前B超也有其局限性：首先，胎儿肾脏在通过B超成像的质量不仅取决于超声设备的技术能力，还取决于操作员的经验和专业知识；再者，在妊娠早期，对于单纯的URA和其它轻微肾脏异常的胎儿，不容易被识别，而且在妊娠后期胎儿肾脏由妊娠早期的高回声变成低回声，扩大的肾上腺等因素也会影响B超判断，所以增加对诊断RA的难度，导致RA胎儿的诊断时间较晚：BRA的平均诊断时间为妊娠24周[11]，URA产前诊断的平均时间为26.5周[15]，甚至可能会造成RA误诊或漏诊率较高。

3 产前MRI

早在1983年MRI就已经在产前作为检查工具[16]。同时，相对于B超在产前诊断中的应用，MRI有助于确认超声检出的异常，更清晰地明确复杂畸形检出、收集系统和血管解剖的显示[17]。有学者对妊娠35周产前B超显示左肾缺如的胎儿进行MRI检查，证实了双侧肾脏的存在[18]。Sohn等[19]通过对56例超声提示胎儿先天异常进行MRI检查，发现有6例胎儿的诊断不一致，并且其中3例胎儿经MRI检查的结果和产后的诊断相同，提示产前超声诊断错误，表明MRI可以为胎儿解剖结构提供了更准确的影像学检查。在产前超声检查结果不明确的情况下，胎儿MRI可作为补充手段，修正B超诊断，明确区分胎儿肾脏与邻居组织器官是否存在或畸形的情况[20]。有学者对妊娠26周的胎儿行产前B超时因羊水过少，未能清晰显示肾脏，无法明确诊断胎儿是否存在BRA，但通过胎儿MRI确认了可以诊断，在妊娠第34周后胎儿自然分娩，并在1 h后死亡，尸检证实BRA诊断[21]。另有一项回顾性分析文献报道MRI对胎儿肾脏异常的诊断准确率为94%(63/67)，充分表明MRI对胎儿RA的确诊具有重要价值[22]。因此，疑似存在包括RA等肾脏异常的胎儿是在产科建议使用MRI检查的唯二个已批准和确定的指标之一[23]。另一方面，关于MRI对孕妇及胎儿的影响，至今没有足够的证据表明产前MRI检查对发育中的胎儿有任何有害报道；相反，研究表明在妊娠中期和晚期对胎儿进行MRI成像在3.0T或更低的范围内是安全的[24]。但MRI造影剂容易经胎盘屏障进入胎儿循环系统，并通过胎儿肾脏过滤后排泄到羊水中可能会导致发育异常，故不常规提供给孕妇[25]。因此在某种程度上，MRI成像水平受到一定的影响，诊断的精确度在某些情况下有所下降，但是产前MRI能协助超声检查更好的了解胎儿肾脏的病理解剖和定位，达到提高并改善孕妇及家属的咨询和妊娠管理[26]。而由于胎儿宫内体位的改变可能也会导致MRI成像困难；另外，MRI的成本较高，因此MRI是否应该成为胎儿RA产前诊断的常规辅助检查还需要进一步的大数据统计分析研究。

4 高通量测序技术（拷贝数变异测序和全外显子测序）

大量研究表明，胎儿RA的病因主要是由遗传因素导致的[27-29]。GDNF-Ret/GFRa1信号通路已被证实在调节胚胎输尿管芽发育中至关重要，它们的缺失或突变将会导致RA[30]。但是它们之间的作用机制尚不清楚。而随着高通量测序技术又称“下一代”测序技术[31]的问世以来，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。RA的诊断和发病机制研究的瓶颈逐渐被打破。

肾脏发育异常50%左右的病因为染色体异常、拷贝数变异（CNV）和单基因遗传病等[5]。CNV作为目前最常见的导致胎儿和儿童出生缺陷的原因，在有结构缺陷的胎儿中，致病性或可能致病性CNVs的患病率为5.5%～10.5%[32]。Cai等[33]通过单核苷酸多态性阵列分析研究表明致病性CNV与肾脏发育有关，并在进一步的研究中发现RA胎儿中致病性CNV发生率较高[34]。Uchiyama等[35]研究表明CNV位点KIF26B可调节胚胎肾脏输尿管芽发育，KIF26B的缺失会导致RA。而CNV-seq作为“新一代”测序技术，运用于胎儿产前诊断，提高了诊断的可靠性、准确性和可重复性，其广泛应用将使致病性或可能致病性拷贝数变异的检出率提高1%[36]。Nagano等[37]通过高通量测序技术在遗传性肾脏疾病的病例中分析检测到的致病性CNV会使EYA1基因缺失，EYA1已被鉴定为GDNF表达的关键调节因子[30]，并且在小鼠中EYA1纯合子缺失将会导致肾脏的缺乏[38]。

外显子是人类基因组的蛋白编码区域，虽然仅占全基因组1%左右[39]，却与人类85%的疾病突变有关[40]。有人认为“新一代”测序技术中的全外显子测序（WES），对超声检测异常的胎儿进行检测，可以提高产前诊断水平[41]。除此之外，WES不仅可以明确胎儿结构畸形的诊断[42]，还可以为肾脏发育异常提供病因诊断[43]。Chatterjee等[4]通过靶向的高通量测序揭示了GDNFRet/GFRa1途径中存在罕见变异或新突变，它们将会导致RA等胚胎肾脏发育异常。最近，一个与RA有关的新候选基因GREB1L出现在人们的视野。有学者通过WES发现GREB1L上存在一个致病性（CADD=33）c.705G＞T错义突变，该基因突变将导致胎儿RA的发生[44]；随后，有研究先通过WES鉴定出GREB1L中的12种杂合变体存在于家族性或单纯性BRA病例中，通过原位杂交，显示了GREB1L在发育中的小鼠肾脏生成区中表达，并且通过CRISPR-Cas9生成了GREB1L基因敲除小鼠模型，结果发现雄性和雌性小鼠胚胎的肾脏发育异常[45]。

综上所述，CNV-seq和WES等高通量测序技术的优势有：扩大了染色体的检测范围，操作简便，并且对母胎安全性高等。若作为产前胎儿RA检测手段，对其诊断及相关遗传因素的寻找无疑是有利的。

5 小结和展望

产前超声是应作为孕妇妊娠期间胎儿RA筛查的常规手段，每个孕妇应该定期行产前B超的检查；若有RA疑似病例，产前B超无法确诊时，可进一步行MRI进行确诊；必要时若评估益处大于有害的情况时，可服用造影剂完善检查。若影像学确诊或怀疑胎儿RA，有需求的孕妇，可选择高通量测序技术帮助诊断及病因的寻找。建议在专业妇产科医生指导下，行CNV-seq寻找相应致病或可能致病的拷贝数变异，若CNV-seq为阴性，可选择WES检测。从而帮助诊断和寻找相关的遗传因素，完善产前管理并为下一次备孕做好相应的遗传咨询，帮助医务工作者作出个性化的防治决策。除此之外，CNV-seq和WES等高通量测序技术应该广泛用于基础研究，有利于更好地找出RA相关遗传因素的病因及相关机制。