可卡因诱导神经细胞自噬的研究进展

沈宝玉，杨根梦，李媛媛，刘 柳，黄 俭，曾晓锋，李利华

（昆明医科大学法医学院，云南昆明 650500）

可卡因又称古柯碱，是古柯树的天然植物产物，由奥地利化学家纽曼于1859 年提纯并命名。可卡因作为古老的滥用毒品之一，具有强效的神经兴奋作用，长期滥用常引起神经毒性和药物依赖。此外，可卡因的长期滥用常伴随HIV 感染[1-2]，给社会公共卫生带来了严重的负担。自噬是一种高度保守的生理机制，可作为细胞短期存活的手段，主要对细胞分解代谢途径进行调控，在维持细胞能量平衡和生长调节上起着重要作用。自噬作为细胞死亡或存活的决定因素和在不良生理条件下的关键防御机制，在最近几年引起了广泛关注[3]。研究表明，可卡因可诱导神经细胞自噬，其诱导自噬的过程由多种机制调控，并在可卡因神经毒性机制中发挥重要作用。本文旨在综述现有证据，探讨可卡因诱导神经细胞自噬的分子机制和可卡因联合HIV 引发的神经毒性。

1 自噬过程

在正常生理条件下，自噬处于较低水平，当细胞处于营养缺乏、缺氧、代谢应激[4-5]等状态时，自噬活性显著上调。自噬过程由一组进化上保守存在的自噬相关（autophagy-related，Atg）基因所介导，其特征为自噬体（Autophagosome）的形成，自噬体由双层膜结构包裹待降解的蛋白质、受损的细胞器或病原微生物等自噬底物而组成，并与溶酶体融合以降解和再循环自噬底物，进而作为细胞存活的能源[6]。根据自噬底物向溶酶体转移的不同机制，可将自噬过程分为3 种不同类型：巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬[7-8]，通常所称的自噬指巨自噬，下文将巨自噬简称为自噬。

自噬体膜的磷脂主要来源于内质网（endoplasmic reticulum，ER）、胞质内颗粒（Endosomes）或线粒体（Mitochondria），并招募含3类磷脂酰肌醇3激酶（Class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的多蛋白复合体[9-11]，其中包含：beclin 1（BECN1）、PIK3C3（PI3K 催化亚基3 型，也称VPS34）、PI3KR4（PI3K 调控亚基4，也称VPS15）、膜曲率感受器Atg14（也称BARKOR）和核受体结合因子2（nuclear receptor binding factor 2，NRBF2）。此外，自噬体的形成是由包含Atg13、Atg101 和unc-51样自噬激活激酶 1（unc-51-like autophagy activating kinase 1，ULK1）的多蛋白复合体所启动的，该复合体在含Atg9 的自噬体膜上装配和活化，并激活Atg9 的磷酸化[12]。随后，VPS34 产生磷脂酰肌醇3-磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P），PI3P 与Atg 蛋白家族结合，并与WD 重复磷酸肌醇相互作用蛋白（WD-repeat protein interacting with phosphoinositides，WIPI）家族进一步促进自噬体膜的扩张直至闭合[13]。自噬体在包裹自噬底物后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（Autolysosomes），而调控该融合过程的分子机制涉及数十种蛋白质，其中大多数涉及内吞相关通路[14]。自噬溶酶体形成后，Atg 偶联系统（Atg conjugation systems）诱导自噬体膜在自噬溶酶体的内部降解[15]，而ATP 依赖性质子泵活性的改变导致了自噬溶酶体内部酸化，最终引起自噬底物的降解[16]。此外，自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合及自噬底物降解的过程与两个泛素样结合系统的活性有关[17-18]。酵母Atg8 在哺乳动物中的同源物被称为微管相关蛋白1 轻链3（microtubuleassociated protein 1 light chain-3，LC3），而Atg3、Atg7 及Atg12-Atg5-Atg16L1 复合物促进了LC3B（LC3β）与磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）结合[19]，LC3 与PE 结合并在自噬体膜发生脂化。脂化的LC3 称为LC3-Ⅱ，在自噬体识别和摄取自噬底物的过程中起着重要的调控作用[20]。

综上所述，自噬过程包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合及自噬底物降解等环节，各环节紧密联系并受多种分子机制调控。此外，Atg 蛋白、BECN1、LC3、LC3-Ⅱ等蛋白常作为自噬的标志物，可通过检测上述蛋白表达水平来判断自噬活性。

2 可卡因诱导神经细胞自噬

体外实验表明，可卡因增加星形胶质细胞中自噬体的形成和自噬标志物蛋白如BECN1、Atg5 和LC3-Ⅱ的表达[21]，并随可卡因剂量和接触时间的增加而上调[22]。此外，可卡因诱导了小胶质细胞自噬体的形成和自噬标记物如BECN1、Atg5、LC3-Ⅱ的表达，并与可卡因剂量和接触时间呈正相关[23]。Guha 等[24]的研究发现，用可卡因处理的皮质神经元，自噬体数量和LC3-Ⅱ的表达显著增加。Lu 等[25]用可卡因处理体外小鼠伏隔核原代细胞，发现自噬体的形成和LC3-Ⅱ的表达增加。此外，可卡因也诱导了人脑血管周细胞（human brain vascular pericytes，HBVPs）中自噬标记物BECN1 和LC3B-Ⅱ的表达上调[26]。

体内实验表明，可卡因可上调小鼠伏隔核中LC3-Ⅱ的表达水平，并诱导自噬体的形成[25]。此外，可卡因增加了小鼠纹状体中自噬标志物BECN1 和LC3B-Ⅱ的表达[21-23]。Guha 等[24]的研究发现，在孕鼠摄入可卡因后生产的小鼠中，其背侧纹状体、皮质、外侧缰核和伏隔核中，LC3-Ⅱ的表达水平显著上调。Sil 等[26]的研究表明，可卡因可诱导小鼠脑血管周细胞中LC3 的表达。综上研究结果表明，可卡因可诱导多种神经细胞自噬。

3 可卡因诱导神经细胞自噬的分子机制

体内和体外研究表明，可卡因可诱导神经细胞自噬，而自噬受多种分子机制调控。以往的研究表明，可卡因可通过内质网（ER）应激、一氧化氮/甘油醛-3-磷酸脱氢酶/Siah1（NO/GAPDH/Siah1）、多巴胺D1 受体/钙-钙调素依赖性蛋白激酶2 型/ 腺苷酸活化蛋白激酶/FoxO3a（DRD1-CaMKII-AMPK-FoxO3a）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和sigma 1 受体（σ-1R）等信号通路诱导神经细胞自噬。

3.1 ER 应激对可卡因诱导神经细胞自噬的调控作用

研究表明，可卡因可诱导星形胶质细胞自噬，自噬抑制剂3-MA 或Wortmannin 可抑制可卡因诱导的自噬。此外，可卡因可上调ER 应激通路标志蛋 白（EIF2AK3、P-EIF2AK3、EIF2S1、P-EIF2S1、ATF6、ERN1、HSPA5 和DDIT3）的表达，而自噬抑制剂不能抑制ER 应激通路标志蛋白的表达上调。另一方面，ER 应激通路抑制剂Salubrinal 或4-苯丁酸钠可抑制可卡因对ER 应激通路和自噬的诱导作用，此外，用siRNA 沉默EIF2AK3 后，显示了同样的结果。综上表明，ER应激通路是可卡因诱导星形胶质细胞自噬的上游部分[21]。Sil 等[26]的研究表明，ER 应激通路作为可卡因诱导人脑血管周细胞（human brain primary pericytes，HBVP）自噬的上游部分而发挥作用。此外，σ-1R 抑制剂BD 1047 可抑制可卡因诱导的ER 应激通路标志物和自噬标志物表达，这表明σ-1R 在ER 应激通路的上游介导了周细胞自噬。Guo 等[23]的研究表明，可卡因可诱导小胶质细胞中ER 应激通路蛋白磷酸化，而ER 应激通路抑制剂Salubrinal、PPP1R3A 及对应的siRNA 均可抑制该诱导作用，并降低自噬标志物LC3-II 的表达。综上，ER 应激通路作为可卡因诱导多种细胞自噬的上游而发挥重要的调控作用。

3.2 NO/GAPDH/Siah1 对可卡因诱导自噬的调控作用

Guha 等[24]的研究表明，可卡因通过NO/GAPDH 级联诱导细胞自噬。可卡因在大脑皮层神经元中引起GAPDH 亚硝化及其核转运。NO/GAPDH/Siah1 信号轴被抑制剂CGP2466B 所抑制后，GAPDH 亚硝化受阻，可卡因诱导的LC3-II表达受抑制；相反地，GAPDH 过表达后，大脑皮层神经元LC3-II 表达水平升高。而在神经型一氧化氮合酶（nNOS）敲出的小鼠皮质神经元中，可卡因不能增加其LC3-II 水平。综上，可卡因可通过NO/GAPDH/Siah1 信号通路诱导自噬。

3.3 DRD1/CaMKⅡ/AMPK/FoxO3a 对可卡因诱导自噬的调控作用

研究表明，可卡因可在体内体外诱导AMPK的磷酸化，而在AMPK 敲除小鼠的伏隔核中，LC3-Ⅱ的表达被显著抑制，这表明AMPK 可在小鼠伏隔核中介导可卡因诱导的自噬[25]。此外，AMPK 被报道可直接调控FoxO3a，FoxO3a 与Atg的启动子区结合，调节自噬活性；而AMPK 在Thr172 位点磷酸化和钙通量相关，CaMKⅡ可能是AMPK 的上游激酶[27]。本研究发现可卡因在体内体外诱导伏隔核神经元中FoxO3a 表达和CaMKⅡ磷酸化，而CaMKⅡ抑制剂KN-93 可阻断可卡因诱导的CaMKⅡ磷酸化、AMPK 磷酸化和LC3-Ⅱ表达。此外，DRD1 抑制剂SCH23390 可阻断可卡因诱导的CaMKⅡ磷酸化、AMPK 磷酸化和LC3-Ⅱ表达。综上表明，可卡因可通过DRD1/CaMKⅡ/AMPK/FoxO3a 信号通路诱导自噬。

3.4 其他信号通路对可卡因诱导自噬的调控作用

研究表明，可卡因可降低小胶质细胞中mTOR通路标志蛋白AKT 和p-RPS6 的表达，这表明mTOR 通路参与了可卡因诱导的小胶质细胞自噬[23]。Walker 等[22]的研究表明，可卡因可诱导星形胶质细胞自噬，并下调mTOR 磷酸化，而mTOR 抑制剂可进一步诱导LC3-Ⅱ的表达，这表明mTOR通路在可卡因诱导自噬中起着负调控的作用。此外，可卡因可诱导σ-1R 的表达，而σ-1R 抑制剂和对应siRNA 均可抑制可卡因诱导的自噬。研究表明，σ-1R 在ER 应激通路的上游介导了可卡因诱导的自噬[23，26]。故σ-1R 相关通路在可卡因诱导自噬中起着一定的调控作用。此外，Bcl-2 作为抗凋亡蛋白，它的磷酸化可使Bcl-2/BECN1 复合物解离，并释放BECN1 参与自噬过程[28]，而可卡因可诱导Bcl-2 磷酸化从而引发自噬[22]。最后，除了BECN1 和Bcl-2，Atg5 和Atg7 也被报道调节自噬。Walker 等[22]的研究表明，可卡因可诱导BECN1、Atg5 和Atg7 的表达，而BECN1、Atg5 和Atg7 对应siRNA 可有效地抑制可卡因诱导的自噬，这表明BECN1、Atg5 和Atg7 对可卡因诱导的自噬起着一定的调控作用。

4 自噬在可卡因神经毒性中的作用

根据以往的研究，可卡因可通过多种信号通路诱导神经细胞自噬，而自噬在可卡因神经毒性中的作用是有争议的。自噬通常被认为是细胞存活的机制，而广泛的自噬可导致程序性细胞死亡，称为自噬性细胞死亡。研究表明，可卡因可诱导自噬性细胞死亡[22，24]，而自噬抑制剂可部分逆转自噬性细胞死亡[22]。此外，自噬介质Atg5 或BECN1 的耗竭可显著降低可卡因的神经毒性[24]。另一方面，自噬在可卡因神经毒性中起着一定的保护作用。当可卡因和自噬抑制剂联合作用于小胶质细胞时，其存活率远低于单一药物作用的小胶质细胞[23]，而可卡因诱导的自噬又引起促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 等的表达[21，23]，从而加重可卡因神经毒性。故自噬在可卡因神经毒性中的作用可能是一个双面且动态平衡的过程，损伤和保护并存。

5 可卡因联合HIV 引发神经毒性

HIV 被分别命名为HIV-1 和HIV-2，HIV 感染主要指HIV-1 感染。CNS 是HIV-1 的一个重要靶点，HIV-1 在感染后的最初几天内进入CNS，并通过HIV 基因编码蛋白如Tat 蛋白和gp120 蛋白引发神经毒性。大量的研究表明，可卡因联合HIV通过破坏血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）完整性、影响神经元代谢、干扰多巴胺系统和改变神经突触可塑性等机制引发神经毒性。

5.1 可卡因联合HIV 破坏BBB 完整性

Gandhi 等[29]使用人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMECs）和星形胶质细胞构建BBB 细胞模型，并测定跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance，TEER）、FITC 标记的葡聚糖转移率、单核细胞迁移率和紧密连接蛋白ZO-1 和JAM-2 的转录和表达变化，综合评价了可卡因与HIV 联合对BBB 完整性的破坏作用。研究表明，可卡因联合HIV-1 Tat 蛋白可显著下调BBB 模型跨内皮电阻和紧密连接蛋白ZO-1 的转录和表达，并上调FITC 标记的葡聚糖转移率、单核细胞迁移率和紧密连接蛋白JAM-2的转录，从而破坏血脑屏障完整性，最终加速HIV-1 相关神经认知障碍（HIV-1-associated neurocognitive disorder，HAND）的 进 程，其 中HIV-1Tat 蛋白C 支起着关键作用[29]。

5.2 可卡因联合HIV 影响神经元代谢

正常的脑功能需要星形胶质细胞与神经元串联的代谢物交换，交换过程受到严密调控，一旦受阻或损害将会引发中枢神经系统损害。Cotto 等[30]的研究表明，可卡因和HIV-1 Tat 蛋白通过干扰肝Ⅹ受体（liver X receptors，LXRs）信号，下调了载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）的表达，并激活甾醇调节结合蛋白（sterol regulatory binding protein，SREBP）通路，导致星形胶质细胞胆固醇失调，从而影响星形胶质细胞向神经元提供所需的胆固醇支持，进而影响神经突触完整性和神经传递，最终引发神经认知障碍。

5.3 可卡因联合HIV 干扰多巴胺系统

研究表明，可卡因和HIV-1 Tat 蛋白可显著上调多巴胺水平，阻碍多巴胺降解，并改变HIV-1Tat 与多巴胺神经末梢的相互作用，从而引发神经病理症状[31]。此外，可卡因和HIV-1 联合作用可干扰多巴胺的再摄取和清除，并改变树突棘形态，从而导致多巴胺系统功能障碍[32]。

6 小结

以往的研究表明，可卡因能够诱导神经细胞自噬，而可卡因诱导的自噬过程由多种机制所调控。同时，可卡因滥用具有强烈的神经毒性，而自噬在其中起着双重作用，目前调控机制不清楚。特别在可卡因滥用合并HIV 中枢感染时，其协同神经毒性机制尚不清楚。因此，研究可卡因诱导的神经细胞自噬机制和可卡因联合HIV 引发的神经毒性机制，有助于解决毒品滥用和HIV 中枢感染的世界公共卫生问题。