氟斑牙儿童甲状腺激素异常与DIO1基因多态性的关系

金祥，崔玉山，曹立春

近年来人群甲状腺疾病谱发生了巨大变化，与1999年相比，2011年我国成人甲状腺肿的患病率明显下降，但亚临床甲状腺功能减退、甲状腺结节患病率快速上升［1］，甲状腺癌发病率也已升至人群癌症发病率的第9 位［2］。甲状腺疾病谱的改变可能与高分辨率B 超等先进技术的普及有关［3］，但是甲状腺疾病与氟关系的研究较少。氟对人体呈现“U”型效应，高氟不仅可引起氟斑牙和氟骨症，已有证据发现其还可损伤动物甲状腺的结构和功能［4］，因此探索氟与人体甲状腺功能改变的关系具有重要意义。

除环境因素外，遗传因素与甲状腺疾病也密切相关［5］。Ⅰ型脱碘酶（type 1 selenodeiodinase，DIO1）可促进甲状腺素（T4）向三碘甲状腺原氨酸（T3）转化，保证血液中T3的含量［6］，是甲状腺激素的关键调节因子。已知DIO1的基因多态性可能与甲状腺的肿大有关［7］。DIO1基因多态性是否可调节氟与甲状腺激素的关系值得深入研究。本研究拟选取正常和氟斑牙儿童，检测儿童甲状腺激素水平，并分析DIO1基因多态性在氟斑牙与甲状腺激素关系中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2018年6月—2019年6月，在天津市历史水氟区和非水氟地区各随机选择1 所小学，分别在3～5 年级用随机整群抽样法抽取4 个班和2 个班，分别抽取当地出生成长的7～12 岁儿童120 名和60 名，经父母知情同意后进行调查。以氟斑牙作为儿童氟暴露指标，检测儿童氟斑牙程度，并对儿童进行问卷的调查。排除父母不同意及信息不全者后，剩余169名儿童纳入本研究。其中正常儿童（正常组）79名，氟斑牙儿童（氟斑牙组）90名。

1.2 氟斑牙的检测 由专业口腔科医生采用我国《氟斑牙诊断》（WS/T 208-2011）标准对儿童氟斑牙进行诊断。本研究将“正常”和“可疑”归为“正常组”，将“极轻”、“轻度”、“中度”和“重度”归为“氟斑牙组”。

1.3 尿碘检测 收集儿童晨尿15 mL，采用砷铈催化分光光度方法（WS/T 107-2006）进行尿碘的检测。

1.4 甲状腺激素和DIO1基因多态性的检测 使用非抗凝管和EDTA抗凝管分别收集3 mL静脉血，非抗凝管血液离心后提取血清，利用化学发光法检测促甲状腺激素（TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）和游离甲状腺素（FT4）。本文参照Chen 等［8］研究，TSH 正常参考值为0.3～5 mIU/L、FT3和FT4正常参考值分别为4.78～6.96 pmol/L和13.4～20.6 pmol/L。

利用血液DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，DP304］提取抗凝管中静脉血DNA，采用Sequenom SNP分型检测实验（MassARRAY 法）测定DIO1 rs2294512 位点的单核苷酸多态性，引物通过Sequenom公司的assay design 3.1软件进行设计，上游引物5′-ACG TTG GAT GGG CCT ATT ACC TGA AAC AGC-3′，下游引物5′-ACG TTG GAT GAG GAG TGA AAA TGG TGC TTG-3′。引物稀释后配置反应体系，进行PCR扩增（95 ℃15 min；94 ℃20 s，56 ℃30 s，72 ℃60 s，45个 循 环；72 ℃3 min；10 ℃保存），SAP（shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶）消化反应，单碱基延伸终止反应，树脂纯化后的延伸产物移至384孔Spectro CHIP芯片上，质谱分析后使用TYPER 4.0软件进行分析并输出结果。

1.5 其他影响因素调查 利用自制的调查问卷对儿童基本情况及潜在甲状腺影响因素进行调查，包括年龄、性别、每日观看电子产品时间、1周中每天锻炼20 min以上的天数、近期是否有大的精神创伤、直系亲属有无甲状腺疾病、生气频率、压力大小等。

1.6 统计学方法 应用SPSS 24.0软件进行数据处理。正态分布计量资料采用均数±标准差（±s）描述，多组间比较采用方差分析，2 组间比较采用t检验；非正态分布资料采用M（P25，P75）描述，2组间比较采用秩和检验。率的比较采用χ2检验、Fisher 确切概率法或秩和检验（指标变量为有序变量时）。基因遗传平衡采用Hardy-Weinberg平衡检验方法。采用二分类Logistic 回归模型分层分析氟暴露对甲状腺激素的影响及强度，第一步进行氟斑牙及其他因素对甲状腺激素影响的单因素分析，其中DIO1 rs2294512位点的基因型分为野生型（AA）和突变型（GA+GG）；第二步，根据基因型分层后，分别将氟斑牙和单因素分析P＜0.2 的因素［9］纳入多因素Logistic分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同地区儿童氟斑牙情况 正常地区共纳入儿童57名，氟斑牙儿童2名（3.5%），历史水氟地区共纳入儿童112 名，氟斑牙儿童88 名（78.6%），两地氟斑牙率差异有统计学意义（χ2=85.498，P＜0.01）。

2.2 2组儿童基本情况 正常组和氟斑牙组儿童性别分布、年龄、BMI和尿碘含量差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。Hardy-Weinberg 平衡检验显示2 组儿童DIO1 rs2294512 位点的基因型频率均符合遗传平衡法则（χ2分别为0.003 和0.251，均P＞0.05）。不同组儿童DIO1 rs2294512 位点基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

Tab.1 Comparison of the basic situation between two groups表1 2组儿童基线情况对比

2.3 2组儿童甲状腺激素水平及异常率比较 与正常组比较，氟斑牙组FT3水平升高，FT4水平下降，FT3/FT4升高（均P＜0.05），但TSH水平差异无统计学意义，见表3。氟斑牙组FT3过高比例较高，而正常组FT4过高比例较高（P分别为0.008和0.039），见表4。

Tab.2 Genotype balance test of DIO1 rs2294512 in two groups of children表2 2组儿童DIO1 rs2294512位点基因型及等位基因频率分布

Tab.3 Comparison of thyroid hormone levels between two groups of children表3 2组儿童甲状腺激素水平比较 （±s）

Tab.3 Comparison of thyroid hormone levels between two groups of children表3 2组儿童甲状腺激素水平比较 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别正常组氟斑牙组t n 79 90 TSH（mIU/L）3.07±1.48 3.25±1.48 0.803 FT3（pmol/L）6.52±0.70 6.75±0.69 2.104＊FT4（pmol/L）18.36±2.08 17.24±1.68 3.840＊＊FT3/FT4 0.36±0.05 0.39±0.05 4.383＊＊

2.4 不同基因型儿童甲状腺激素水平 DIO1 rs2294512位点上AA为野生型，GG为突变型，GA为混合型，加性模型（AAvs.GAvs.GG）、显性模型（AAvs.GA+GG）和隐性模型（AA+GAvs.GG）3 种模型不同亚组间甲状腺激素水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表5。

2.5 FT3和FT4过高率影响的单因素分析 分析FT3和FT4过高比例变化的影响因素，研究样本量分别为168 和167 例。结果显示，正常儿童的FT3过高率低于氟斑牙儿童，但FT4过高率高于氟斑牙儿童（P＜0.05）。不同压力儿童FT4过高率分布差异有统计学意义（P＜0.05），见表6。

2.6 不同DIO1基因型儿童氟暴露和甲状腺激素异常的关系 分析FT3过高影响因素时，以FT3是否异常为因变量（正常=0，过高=1），自变量为氟斑牙水平（正常=0，氟斑牙=1），调整因素为年龄（＜9 岁=0，≥9岁=1）和每日观看电子产品时间（≤1 h=0，＞1 h=1）；分析FT4过高影响因素时以FT4是否异常为因变量（正常=0，过高=1），自变量为氟斑牙水平（正常=0，氟斑牙=1），调整因素为压力（很小=0，一般=1，较大=2）。结果显示，总人群及DIO1基因为AA基因型儿童，氟斑牙儿童较正常儿童更易FT3过高，而未发现GA+GG基因型儿童氟斑牙与FT3过高之间存在关联。总人群中，氟斑牙儿童相较正常儿童不易FT4过高（P=0.035），但根据DIO1基因分层后，未发现氟斑牙与FT4过高之间存在关联，见表7。

Tab.4 Comparison of thyroid hormone abnormality between two groups of children表4 2组儿童甲状腺激素水平正常与异常分布的比较 例（%）

Tab.5 Comparison of thyroid hormone levels between different genotype children表5 不同基因型儿童甲状腺激素水平比较（±s）

Tab.5 Comparison of thyroid hormone levels between different genotype children表5 不同基因型儿童甲状腺激素水平比较（±s）

均P＞0.05

模型加性模型n 88 66 15显性模型88 81隐性模型基因型AA GA GG F AA GA+GG t AA+GA GG t 154 15 TSH（mIU/L）3.22±1.55 3.13±1.31 3.01±1.83 0.179 3.22±1.55 3.10±1.41 0.535 3.18±1.45 3.01±1.83 0.432 FT3（pmol/L）6.59±0.64 6.74±0.77 6.53±0.74 1.033 6.59±0.64 6.70±0.77 0.982 6.66±0.70 6.53±0.74 0.672 FT4（pmol/L）17.70±1.86 17.74±2.14 18.28±1.61 0.567 17.70±1.86 17.84±2.06 0.430 17.71±1.98 18.28±1.61 1.062 FT3/FT4 0.37±0.05 0.38±0.06 0.36±0.06 1.256 0.37±0.05 0.38±0.06 0.199 0.38±0.06 0.36±0.06 1.278

Tab.6 The influence of other factors on high FT3 and FT4表6 其他因素对FT3和FT4过高的影响

Tab.7 Logistic analysis of the relationship between high FT3 and FT4 and dental fluorosis in children withdifferent DIO1 genotypes表7 不同DIO1基因型儿童氟斑牙FT3和FT4过高影响的Logistic分析

3 讨论

3.1 氟是甲状腺结构和功能的影响因素 氟是人体必需的微量元素，适量的氟对人体的生长发育具有重要的作用，人体摄入过低时会造成龋齿等现象；而摄入过高时，也会对人体的健康造成损害。有研究发现，随着总摄氟量的增加，儿童氟斑牙患病率逐渐在增加，呈显著的剂量-效应关系［10］，因此氟斑牙常作为氟的内暴露指标。氟过量除了可引起骨相组织的改变，还可损伤神经系统、生殖系统等［11］。氟对甲状腺的影响也得到了初步的研究，动物实验已证实高氟可影响大鼠甲状腺的结构，导致甲状腺激素分泌紊乱［4］。甲状腺疾病谱近几年发生了较大的变化，其是否与氟暴露有关值得深入研究。

人群流行病学调查研究同样发现高氟可扰乱人群甲状腺激素，但结果存在差异。Zhang 等［12］发现高氟地区儿童与对照儿童相比，T3水平无变化，但T4水平下降，TSH 水平上升。向杰等［13］则发现饮水型氟中毒重病区儿童TSH 高于正常水氟地区，总T3和总T4水平无差异。本研究未探讨不同水氟地区儿童甲状腺激素差异，而是根据儿童氟斑牙情况进行分组，探讨儿童甲状腺激素水平差异，发现TSH 无差异，但是氟斑牙儿童FT3水平高于正常儿童，FT4水平较低，且FT3和FT4过高比例存在差异。考虑到甲状腺激素降低和升高的机制可能不同，且本研究FT3和FT4过低比例均较低，因此多因素分析只探讨了氟斑牙对甲状腺FT3和FT4过高关系，发现氟暴露易使FT3过高，而不易使FT4过高。

3.2 DIO1 rs2294512基因多态性在氟影响甲状腺激素中的调节作用 DIO1是硒酶家族的一员，其可催化碘化甲状腺氨酸选择性去碘，哺乳动物肝脏、肾脏和甲状腺均可高表达DIO1，且肝脏DIO1 活性被认为是甲状腺功能正常状态下机体维持血浆T3水平的关键［14］。有学者对DIO1 基因多态性与甲状腺疾病和甲状腺激素关系进行了研究，如AlRasheed 等［15］的研究未发现DIO1 rs2294512位点的多态性与甲状腺癌之间的关系；而王文强［7］认为DIO1 rs2294512位点的多态性可能与甲状腺的肿大有关，等位基因A携带儿童更易患甲状腺肿大；Panicker等［16］研究了DIO1 基因9 个位点多态性与甲状腺激素的关系，发现DIO1 rs2235544和rs11206244位点与FT3/FT4比例有关，且rs2235544 位点C 等位基因导致FT3水平上升、FT4水平下降。本研究显示携带DIO1 rs2294512位点AA型的儿童易受氟的影响，导致FT3过高比例增加。

综上所述，氟斑牙儿童FT3水平较高，FT4水平较低，FT3过高率偏高且FT4过高率偏低，未发现DIO1 rs2294512位点的多态性与FT3和FT4之间的关系，但是携带DIO1 rs2294512位点AA型的氟斑牙儿童FT3水平易升高。