针刺对脑卒中大鼠炎症损伤及miR-214的影响

李春琴，邓寒冰，张粲，金祖敏

脑卒中具有高病死率、高致残率的特点，患者易出现认知功能障碍致生存质量较差［1］。脑卒中患者脑梗死区免疫细胞特别是中性粒细胞可通过受损血脑屏障移至受损部位，促进促炎因子生成，进而发挥免疫防御作用；促炎因子分泌过剩可诱导免疫级联放大反应，导致氧化应激等反应发生，影响细胞功能，从而使疾病加重［2］。因此，减轻脑组织中炎症反应对于治疗脑卒中意义重大。研究显示，持续对脑出血大鼠行针刺治疗可减轻其炎症反应，但具体机制尚不清楚［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）在细胞增殖、细胞分化、炎症反应及组织纤维化等方面发挥重要作用，可影响疾病进程。研究显示，miR-214可通过调控第10 号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）及白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达，影响卒中进展［4-5］。针刺是否可影响miR-214及其下游信号通路水平，从而影响疾病进展尚不清楚。因此，本研究建立大鼠脑卒中模型，探究针刺阳陵泉、曲池穴位对脑卒中大鼠炎症损伤的影响，以期为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色试剂盒、苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；miRNA 提取试剂盒、miRNA cDNA 第一条链合成试剂盒、miRNA 荧光定量检测试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；兔源PTEN、丝苏氨酸蛋白激酶（threonine protein kinase，AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-6、内参GAPDH、LaminB 一抗以及羊抗兔二抗（英国abcam 公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；康岭G91-E电针仪（扬州康岭医用电子仪器有限公司）；实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）仪7500（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 实验动物 48只SPF级、45日龄的SD大鼠，雌雄不限，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2017-0033；体质量200～220 g，动物实验中心温度（25±1）℃、湿度（55±5）%、12 h/12 h（光照/黑暗）饲养。本实验经本院伦理委员会审核通过。

1.3 动物模型建立与分组 以随机数字表法抽取36 只大鼠，参照文献［6］以改良Longa 线栓法建立大鼠脑卒中模型，左颈部去鼠毛、消毒，分离出左侧颈总动脉、颈外动脉并结扎；分离颈动脉，于颈内动脉与颈外动脉分叉膨大处切口，尼龙线插入颈内动脉切口端并与颈内动脉一起结扎。术后2 h Longa评分法验证模型情况，36只大鼠卒中模型均成功，以随机数字表法分为模型组、针刺组、阳性对照组，每组12只。余12只大鼠设为假手术组，仅分离颈总动脉，不结扎、不切口、不插线，其余步骤与大鼠脑卒中建立模型相同。

1.4 模型处理 参照文献［7］中动物针灸穴位图谱并结合解剖学方法，根据穴位走向，针刺组大鼠针刺阳陵泉（双）、曲池（双），1 次/d，每次留针30 min，留针期间每10 min 行针1 次（频率：80次/min；捻转角度：180°；持续时间：1 min）。阳性对照组采用0.4 mg/kg 尼莫地平溶于1 mL 生理盐水中灌胃［8］，1次/d，7 d为1个疗程，连续2个疗程。假手术组针刺非穴位处作为对照，假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水，均干预14 d。

1.5 Longa评分评价大鼠行为学情况 5分制神经功能缺失评分：无神经功能症状为0 分，不能完全伸展对侧前爪为1分，爬行时偏瘫侧旋转为2 分，行走时对侧倾倒3 分，不能自发行走为4分，死亡为5分。

1.6 TTC 染色检测大鼠脑梗死体积 每组大鼠以随机数字表法抽取4 只取全脑组织置于-20 ℃冰箱中冷冻25 min，脑组织横切成6 片，0.1%TTC 溶液中37 ℃孵育15 min，10%福尔马林室温固定1 h，拍照并用Image-J v1.8.0 软件分析梗死百分比。梗死区呈白色，正常脑组织呈红色。脑梗死体积（%）=白色体积/总体积×100%。其余8只部分大脑冠状部置于4%多聚甲醛中固定，用于HE 染色，其余置于-80 ℃冰箱备用。

1.7 HE染色观察大鼠大脑冠状部情况 每组另外8只部分经4%多聚甲醛中固定过夜后的大脑冠状部，制备6 μm厚度常规石蜡切片，按HE染色试剂盒步骤对切片染色，中性树胶封片，显微镜（×200）拍照观察大脑冠状部情况。部分大脑冠状部行qPCR和蛋白免疫印迹实验。

1.8 qPCR检测大脑冠状部miR-214相对表达水平 部分大脑冠状部研磨充分，miRNA 提取试剂盒提取miRNA，miRNA cDNA第一条链合成试剂盒合成cDNA。miR-214引物：上游5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3′，下 游5′-TTAGCCCGCTCAACACT-3′；U6引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应体系20 μL：cDNA（50 ng/μL）1 μL、2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μL、上游/下游引物（10 μmol/L）1 μL、ddH2O 8.0 μL。反应条件：94 ℃90 s；95 ℃32 s，61 ℃35 s，45 个循环；72 ℃10 min。2-ΔΔCt法对大脑冠状部中miR-214表达水平进行定量分析。

1.9 蛋白免疫印迹检测大鼠大脑冠状部PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6 蛋白表达情况 各组取部分大脑冠状部充分研磨，取部分采用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，用于检测PTEN、AKT、p-AKT、IL-6、GAPDH；其余部分采用相应试剂盒提取组织细胞浆和细胞核中蛋白用于检测细胞浆中NF-κB 以及细胞核中NF-κB、LaminB。蛋白定量后行SDSPAGE 电泳、转膜，封闭后加入对应一抗4 ℃过夜孵育；加入对应二抗，室温孵育1 h，显色后拍照片并用Image-J v1.8.0分析灰度值。蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/对应内参灰度值。

1.10 统计学方法 采用GraphPad 8.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q法，组内处理前后比较采用配对t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠Longa评分比较 （1）组间比较。建模后处理前，与假手术组比较，模型组、针刺组、阳性对照组Longa 评分升高（P＜0.05），而后3 组间差异无统计学意义（P＞0.05）。处理结束后，与假手术组比较，模型组、针刺组、阳性对照组Longa 评分升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组、阳性对照组Longa评分降低（P＜0.05）。（2）组内比较。与建模后处理前比较，处理结束后针刺组、阳性对照组Longa评分降低（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of Longa scores of rats between the four groups表1 4组大鼠处理前后Longa评分比较（n=12，分，±s）

Tab.1 Comparison of Longa scores of rats between the four groups表1 4组大鼠处理前后Longa评分比较（n=12，分，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 与假手术组比较，b 与模型组比较，P＜0.05；针刺组与阳性对照组不做比较

组别假手术组模型组针刺组阳性对照组F建模后处理前0.00±0.00 2.47±0.28a 2.52±0.31a 2.50±0.34a 257.912＊＊处理结束后0.00±0.00 2.79±0.34a 1.17±0.34ab 1.43±0.28ab 203.353＊＊t 0.000 1.861 2.753＊8.510＊＊

2.2 各组脑梗死体积比较 假手术组、模型组、针刺组及阳性对照组的脑梗死体积分别占（0.00±0.00）%、（31.46±4.16）%、（16.35±3.14）%、（25.34±3.63）%（n=4，F=74.224，P＜0.05），其中与假手术组比较，模型组、针刺组、阳性对照组脑梗死体积均增大（P＜0.05）；与模型组相比，针刺组脑梗死体积减小（P＜0.05），见图1。

Fig.1 Cerebral infarction of rats in the four groups图1 4组大鼠脑梗死情况

2.3 各组大鼠大脑冠状部形态变化 假手术组大脑冠状部完整、清晰，皮层神经元细胞正常、排列整齐；模型组可见皮层神经元细胞排列紊乱，有明显的炎症细胞浸润现象，纤维化严重；针刺组和阳性对照组皮层神经元细胞排列较紊乱，炎症和纤维化现象减轻，见图2。

Fig.2 Morphological comparison of the coronary region of rat brain in the four groups(HE staining,×200)图2 4组大鼠大脑冠状部形态学比较（HE染色，×200）

2.4 电针对大鼠大脑冠状部miR-214相对表达水平的影响 假手术组、模型组、针刺组及阳性对照组的大脑冠状部miR-214相对表达水平分别为（1.00±0.21）、（2.13±0.46）、（1.56±0.35）、（1.61±0.32），差异有统计学意义（n=8，F=14.207，P＜0.05），其中与假手术组比较，模型组、针刺组、阳性对照组大脑冠状部中miR-214水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组、阳性对照组大脑冠状部中miR-214水平降低（P＜0.05），而后2组间差异无统计学意义。

2.5 电针对大鼠大脑冠状部PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6 的影响 与假手术组比较，模型组、针刺组、阳性对照组大脑冠状部中PTEN，模型组细胞浆中NF-κB蛋白相对表达水平降低（P＜0.05），模型组大脑冠状部中p-AKT/AKT、IL-6，阳性对照组细胞浆中NF-κB，模型组、阳性对照组细胞核中NFκB 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，针刺组、阳性对照组大脑冠状部中PTEN、p-AKT/AKT、细胞浆NF-κB 蛋白相对表达水平升高，细胞核NF-κB、IL-6 蛋白相对表达水平降低（P＜0.05），见图3、表2。

3 讨论

脑卒中属传统医学“中风”范畴，为风痰瘀阻、痰热腑实、气虚血瘀、阴虚风动等证型［9］。传统医学根据其发病机制，通常采用活血化瘀、熄风化痰、通腑泻火方案治疗该病。针刺穴位有行气活血、舒经活络功效，可改善局部病灶处血液循环，抑制炎症，缓解炎症反应［10-11］。其中，阳陵泉归于足少阳经合土穴，属八会穴之一，有舒筋通络、通经止痛功效；在治疗膝关节骨性关节炎中可改善局部微循环，增加血液供应，从而达到清除致痛物质的目的［12］。曲池属手阳明大肠经合穴，有激发经气之功效；在治疗过敏性鼻炎中可增加抗炎作用，减少巨噬细胞和T 淋巴细胞的分泌，促进局部致病因子分解，减少疼痛，亦可抑制毛细血管通透性增加［13］。本研究中，与假手术组比较，模型组、针刺组、阳性对照组Longa 评分升高，表明大鼠出现神经损伤情况，提示造模成功；模型组脑梗死体积增大，大鼠大脑冠状部出现明显的炎症损伤和纤维化现象，提示脑卒中可致血液供应不足，促使冠状部发生炎症反应和纤维化，导致脑梗死发生。与模型组比较，针刺组Longa 评分降低，提示针刺可缓解大鼠神经损伤。针刺组脑梗死体积减小，大脑冠状部炎症减弱，提示针灸通过疏经通络等作用可改善局部微循环及血液循环，从而促进部分梗死区域供血，恢复其功能，同时亦可改善炎症现象，达到缓解疾病目的，但具体机制尚不明确。

miRNA 具有多重功能，高度保守且具有细胞特异性，可调控靶基因的转录、翻译等过程，从而调控基因表达，影响其功能。其中，miR-214位于1 号染色体长臂（1q24.3）钙离子重吸收相关基因Dnm3 基因内，影响皮层神经元、大脑皮层发育以及胚胎干细胞神经分化，从而影响神经发育和再生［14］。对小鼠骨关节炎模型的研究显示，随着病情加重，miR-214水平升高并加重了骨关节炎软骨损伤［15］。而miR-214可抑制血管内皮细胞增殖，促进细胞凋亡和上调炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 表达水平［16］，但具体机制并不明确。有研究显示，miR-214可通过靶向PTEN 来影响下游AKT/NF-κB/IL-6 信号通路的表达而发挥作用，进而影响细胞增殖、凋亡，及炎性因子表达水平［17-18］。另有研究显示，溃疡性结肠炎小鼠miR-214表达水平升高，PTEN表达水平降低，PTEN对AKT的抑制作用降低，导致AKT水平升高，进而促进转录因子NF-κB 分泌，上调IL-6、IL-1β、TNF-α等，发挥促炎作用［19］。本研究发现，与假手术组比较，模型组大脑冠状部miR-214水平升高，p-AKT/AKT、细胞核NF-κB 和IL-6 蛋白水平升高，PTEN、细胞浆NF-κB 蛋白水平降低，表明脑卒中后miR-214水平升高可能导致炎症反应加重以及相关蛋白表达水平的改变，提示脑卒中大鼠大脑冠状部中miR-214水平异常升高后可能抑制PTEN表达，使PTEN 对AKT 的抑制作用减弱，AKT 活化水平升高，从而促进转录因子NF-κB由胞浆进入细胞核，促进促炎因子的分泌，加重炎症反应及神经损伤。进一步研究发现，与模型组比较，针刺组miR-214水平降低，p-AKT/AKT、IL-6、细胞核NF-κB 蛋白水平亦降低，而PTEN、细胞浆NF-κB 蛋白水平升高，提示针刺可降低miR-214水平，而miR-214水平降低减弱对PTEN的抑制作用，促进PTEN水平升高，PTEN水平升高则加强对AKT 的抑制作用，AKT 受到抑制，从而降低转录因子NF-κB由胞浆进入细胞核过程，减少炎性因子分泌，减缓炎症反应，实现对脑卒中大鼠脑组织的保护。

Fig.3 Protein levels of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 in the coronary region of rat brain in the four groups图3 4组大鼠大脑冠状部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平

Tab.2 Comparison of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 protein levels in coronary region of rat brain between the four groups表2 4组大鼠大脑冠状部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平比较 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 protein levels in coronary region of rat brain between the four groups表2 4组大鼠大脑冠状部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平比较 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与模型组比较，P＜0.05；针刺组与阳性对照组不做比较

组别假手术组模型组针刺组阳性对照组F PTEN 1.36±0.28 0.21±0.06a 0.89±0.14ab 0.95±0.21ab 49.876＊＊AKT 0.83±0.12 0.84±0.15 0.82±0.14 0.84±0.15 0.037 p-AKT/AKT 0.93±0.15 1.53±0.18a 0.96±0.17b 1.06±0.15b 23.421＊＊组别假手术组模型组针刺组阳性对照组F NF-κB细胞浆0.74±0.11 0.09±0.02a 0.78±0.05b 0.86±0.05ab 230.690＊＊细胞核0.26±0.04 0.90±0.12a 0.21±0.05b 0.41±0.05ab 151.213＊＊IL-6 0.15±0.01 0.86±0.12a 0.12±0.03b 0.21±0.05b 221.497＊＊

综上所述，针刺脑卒中大鼠可减轻其脑组织炎症损伤，可能是通过抑制miR-214水平及下游PTEN/AKT/NF-κB/IL-6 信号通路实现的；但miR-214影响的通路较多，亦可能影响别的通路，实现对炎症的调节，需在进一步研究中发现其机制。