鸡球虫病疫苗稀释剂配方的初步筛选

武一帆，范炳灵，郭露露，马晓兰，赵 彤，郑明学

（山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）

鸡球虫病是一种危害严重的寄生虫疾病，在养殖场内非常多见，每年因球虫病造成的直接经济损失和用于预防球虫病的药物、疫苗等间接费用巨大，据统计，全世界因该病而引起的损失每年超过30亿美元[1]。即使大型养殖场在饲养管理、饲料营养等方面有了很大的改善和提高，但是仍然不能杜绝球虫病的发生。因此，长期饲养的鸡一般都会使用鸡球虫病的疫苗来免疫预防球虫病。

在临床实际中，常用的鸡球虫病疫苗均为活卵囊疫苗，主要有灌口、饮水、拌料和喷雾等多种免疫方法[2]。其中，灌口接种法操作较为繁琐，应激大；饮水免疫法需要特殊的助悬剂，雏鸡日龄小饮水量不够，无法保证免疫效果；拌料免疫法是手工操作，容易出现拌不匀或个体食量差异问题，造成免疫不均；喷雾免疫法是近几年才出现的一种免疫方法，它能大幅度降低人力物力，适合于大型的鸡场，但用水作为稀释剂喷出的雾滴，容易滚落到地上，造成卵囊的损耗，同时水滴易干，疫苗在干燥的空气中失去活性，也会降低鸡的免疫效果。ALBANESE等[3]采用凝胶稀释剂稀释疫苗，能让更多的疫苗液滴黏附在鸡羽毛上而不易掉落，从而使鸡有更多时间进行整理和摄取卵囊。但国内在本研究领域暂无文献报道。因此，本研究基于鸡球虫病疫苗的特性、鸡自然特性及免疫途径多方面因素考虑，寻找一种具有助悬效果，可以均匀携带球虫卵囊及大量水分并黏附于鸡只体表，即集黏度、保湿、生物安全和可食用性于一体的材料用作疫苗稀释剂。

黄原胶是一种高分子量多糖，是目前国际上集增稠、悬浮、稳定、乳化于一体，性能优越的生物胶，无臭、无味、无毒、生物安全，广泛应用于药物和食品领域。同时它是典型的非牛顿流体，其水溶液具有极高的假塑性[4]，有利于喷雾液滴的形成。石点等[5]研究结果表明，1%的黄原胶黏度大约为2 500 mPa·s。

海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种多糖碳水化合物，具有优良的稳定性、成膜性、抗菌性、无毒无味、可生物降解、生物相容性好等诸多优点，且成本较低，可作为可食膜材料，用于黏附给药途径的生物制剂和疫苗蛋白多肽的药物载体[6-8]。刘晓静等[9]研究表明，1.0%的海藻酸钠处理在抑制莲藕表皮褐变方面效果良好，经0.8%、1.0%、1.2%浓度涂膜处理后的莲藕失重率分别为7.5%、2.0%、4.5%。罗海莉[10]研究表明，海藻酸钠浓度越高，膜厚度越大，透光率越低，其中，2%海藻酸钠成膜性最佳。于子森等[11]研究表明，1%的黏度在300～350 mPa·s，2%的黏度在2 000～3 000 mPa·s，3%的黏度在15 000～20 000 mPa·s。咸娜[12]研究指出，黄原胶和海藻酸钠复配具有协同性，溶液的黏弹性大于单体胶，0.5%的黄原胶和海藻酸钠复配9∶1时黏度最高，在800～1 000 mPa·s；1%的黄原胶和海藻酸钠复配4∶6黏度最高，在3 000～3 500 mPa·s。英特维特国际股份有限公司[13]发明的一种可用常规喷雾装置进行喷雾的球虫疫苗专利，表明200～4 000 mPa·s黏度含黄原胶成分的溶液喷雾时更容易形成不会打湿鸡只羽毛的小液滴。

甘油作为一种亲水性材料，无色、略带甜味、无臭、透明，它能轻易地插入多糖分子链，并和分子链上的亲水基团结合形成氢键。当亲水性的甘油各分子参与成键作用成功，多糖膜在分子内或分子间本身的相互作用能力就会大大地减弱，因此，多糖膜结构的刚性被削弱，其膜的柔韧性增加，故达到了改善多糖膜机械和化学性能的目的，使多糖膜变得柔软、有光泽并且富有弹性[14-15]。罗海莉[10]在试验中添加了1%的甘油作为增塑剂，有效地改善了海藻酸钠的成膜性。郑长兴[16]研究指出，在蒸馏水中加入5%的甘油能有效防止喷出的雾滴迅速被蒸发掉。

本试验以黄原胶、海藻酸钠为主要原料，以甘油为增塑剂、保湿剂，通过正交试验设计不同配方，测定黏度、黏壁率、沉降率、失水率等指标，同时结合临床实际应用及生产成本选出悬浮稳定性合格、雾滴持水性好、黏壁率高、价格低廉的最优配方，旨在为球虫喷雾免疫研究提供合理参数及配方。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要原料 黄原胶，食品级，鄂尔多斯市中轩生化股份有限公司；海藻酸钠，食品级，青岛明月海藻集团有限公司；丙三醇，分析纯，天津易发化学试剂厂。

1.1.2 虫株 鸡堆型艾美耳球虫（Asx）由山西农业大学动物医学学院兽医病理实验室保存并提供。

1.1.3 主要仪器设备NDJ-1型旋转黏度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）、恒温箱（上海博迅实业有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 配方设计 混合使用黄原胶、海藻酸钠、甘油浓度3种成分，设置黄原胶（因素A）3个水平，分别为0.4%、0.6%、0.8%；海藻酸钠（因素B）3个水平，分别为0、0.1%、0.6%；甘油（因素C）3个水平，分别为0、1%、5%。按照表1疫苗稀释剂配方进行L9（34）正交试验设计。

表1 正交试验设计

1.2.2 疫苗稀释剂的制备 分别取100 mL去离子水依次加入到9个干燥洁净的小烧杯中，按表1对应加入甘油，备用。取9个小玻璃瓶，按表1称取各处理物质，用锡纸密封，摇晃混匀，再用牙签在锡纸上均匀地扎6个小孔，将小玻璃瓶中原料撒入对应的小烧杯中，边加边用玻璃棒搅拌，静置1～2 h，使溶液均匀一致接近无色透明（肉眼不可见颗粒），然后分别以2 000 r/min离心5 min，取出倒回烧杯，待用。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 黏度测定 采用NDJ-1型旋转黏度计进行测定，记录3号转子、30 r/min下各处理的黏度。

1.3.2 黏壁率测定 取9个100 mL小烧杯，编号T1～T9，称质量（A），并记录；然后取9个处理球虫疫苗喷雾免疫稀释液于对应的烧杯中，称质量（B），并记录。称量完成后将烧杯内液体垂直倾倒出，待到液体断流，收起烧杯，称量倾倒后烧杯的质量（C），并记录。

1.3.3 失水率测定 取9个规格相同洁净干燥的平皿，编号T1～T9。称取20 g各处理疫苗稀释液于不同的平皿中，称质量（W0），并记录。称量完成后将上述平皿置于33℃恒温箱中，于放置后1、6、12、24、48、72 h称质量（Wt），并记录。

1.3.4 沉降率测定 取9只10 mL离心管，分别加入1 mL（50 000个/mL）球虫卵囊液，2 500 r/min离心10 min，弃上清，用玻璃棒搅匀沉淀；沉淀搅开后，分别加入各处理球虫疫苗稀释剂10 mL，从不同方向（顺时针、逆时针、上下）反复搅拌，使球虫卵囊在稀释液内均匀分布；于配制球虫疫苗混悬液后的0、4、8 h，用移液枪在10 mL离心管上、中、下3层分别吸取10μL球虫疫苗混悬液，在10×10显微镜下计算卵囊数，每处理各取样3次，取平均值，以0 h混悬液的卵囊平均数为基数。若8 h的球虫沉降率小于10%，表明卵囊既不上浮也不沉降，符合混悬要求。

1.4 数据处理

数据采用Excel软件进行处理，以“K值＋R值”表示。

2 结果与分析

2.1 黏度分析

从图1可以看出，黏度值整体呈上升趋势。由表2可知，黄原胶的黏度值K值大小表现为K3＞K2＞K1；海藻酸钠的K值大小表现为K3＞K2＞K1；甘油的K值大小表现为K2＞K3＞K1，表明稀释剂黏度随着胶体成分浓度的增加而增加，其中，对黏度值影响最大的是黄原胶（极差R为0.897），其次依次是海藻酸钠（极差R为0.307）和甘油（极差R为0.097）。

表2 黏度K值和极差R

2.2 黏壁率分析

从图2可以看出，黏壁率整体呈上升趋势。从表3可以看出，黄原胶黏度率的K值大小表现为K3＞K2＞K1，海藻酸钠的K值大小表现为K3＞K2＞K1，甘油的K值大小表现为K1＞K2＞K3，因此，黏壁率的最优水平组合是A3B3C1；其中，对黏壁率影响较大的是黄原胶（极差R为12.663），其次依次是海藻酸钠（极差R为4.217）和甘油（极差R为0.250）。

表3 黏壁率K值和极差R值

2.3 失水率分析

不同处理12 h之前的失水率无明显差别，12 h后不同处理各时间段以T7处理失水率最低，表现出明显优势（表4）。不同处理1 h时的失水速率差异明显，T7处理的失水速率最低，12 h后不同处理失水速率变化均不明显（表5）。黄原胶失水率的K值大小表现为K1＞K2＞K3，海藻酸钠的K值大小表现为K1＞K3＞K2，甘油的K值大小表现为K2＞K1＞K3，因此，失水率的最优水平组合是A3B2C3；其中，对失水率影响较大的是甘油（极差R为10.667），其次依次是黄原胶（极差R为4.000）和海藻酸钠（极差R为3.167）（表6）。

表4 各时间段各组失水率 %

表5 各时间段各组失水速率 g/h

表6 失水率K值和极差R值

2.4 沉降率分析

表7 沉降率试验结果

表8 沉降率K值和极差R值

T3～T9处理8 h的沉降率均小于10%，表明卵囊既不上浮也不沉降，符合混悬要求（表7）。黄原胶沉降度的K值大小表现为K1＞K2＞K3，海藻酸钠的K值大小表现为K1＞K2＞K3，甘油的K值大小表现为K1＞K2＞K3，因此，沉降率的最优水平组合是A3B3C3；其中，对沉降率影响较大的是黄原胶（极差R为10.883），其次是海藻酸钠（极差R为5.100），再次是甘油（极差R为4.817）（表8）。

3 结论与讨论

本研究通过对黏度及黏壁率试验结果分析可知，胶体浓度升高，黏度升高、其黏壁率也升高；而甘油的浓度与黏度及黏壁率间无明显变化规律。姚云真等[14]研究了不同浓度甘油对不同种明胶溶液黏度的影响，结果显示，并非甘油浓度越高黏度越高；王利强等[17]研究表明，甘油浓度的增加会使总成膜液的黏度上升，0的甘油黏度度量值为10.01，1%为13.48，2%为13.24，可以看出，2%的黏度度量值比1%的低，与本试验研究结果相符。甘油浓度与黏度间的变化规律性还有待进一步研究。

本研究失水率试验结果显示，甘油对失水率的影响最大，其保湿原理是由于其含有3个羟基（丙三醇），易亲水，能吸收空气中的水分，还可以防止水分蒸发，因此，具有良好的保水性[18]。黏壁率、失水率、沉降率最优组合分别为A3B3C1、A3B2C3、A3B3C3，可以发现，黄原胶可选水平为A3，海藻酸钠可选水平为B2和B3，甘油的可选水平为C1和C3。黄原胶作为影响黏壁率、沉降率的主要因素，优选时应该选择更高浓度的水平以提高黏度，但考虑到原料的成本问题和喷雾仪器的配适问题，选择达到混悬效果的低用量处理即可，故A2也是黄原胶的可选水平。综上，黄原胶、海藻酸钠和甘油以A2B1C3的组合为宜。

有研究表明，黄原胶主要与魔芋胶的复配效果较好[19]。王元兰等[20]研究表明，黄原胶和魔芋胶以不同比例复配均有明显的协同作用。因此，在后续的研究中，黄原胶和魔芋胶复配的组方还有待深入探讨。