CCR3联合Cyclin D1在幽门螺旋杆菌感染所致胃癌及癌前病变中的诊断价值

毛 勇,王 军,陈文燕

(六安市中医院检验科,安徽 六安 237006)

最新癌症统计数据显示,胃癌已经成为我国癌症发病率第二高的恶性肿瘤,胃癌的死亡率居所有癌症死亡率的第三位[1]。研究显示,我国幽门螺旋杆菌(H.pylori)感染率约为59%,且在逐年增加。有研究表明约15%的H.pylori感染患者可出现消化道溃疡,而慢性活动性胃炎患者中,H.pylori感染率达到90%以上[2-4]。H.pylori作为常见感染性病原体,被认为是癌前病变及胃癌的重要致病因素[5]。因此,为H.pylori感染患者进行胃癌及癌前病变精准诊断对临床治疗和提高患者预后意义重大。趋化因子受体3(CCR3,C-C chemokine receptor type 3)是G蛋白偶联受体中的一种[6],近年来研究发现,CCR3在肿瘤中高表达且促进了肿瘤的发生、发展以及转移[7]。细胞周期蛋白 D1(Cyclin D1)主要参与细胞G1期限制点的调控,其表达异常所引起的细胞周期失控是细胞异常增殖而导致癌变的重要原因[8]。然而CCR3和Cyclin D1在H.pylori感染所致胃癌及癌前病变中的诊断研究较少。因此,研究探究CCR3联合Cyclin D1诊断H.pylori感染所致胃癌及癌前病变的价值,以期为胃癌及癌前病变诊断提供新的生物标志物。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月—2019年2月在六安市中医院接受纤维胃镜及病理检查的H.pylori患者,其中:(1)明确诊断为胃癌的患者104例(胃癌组),其中男63例、女41例,年龄≥60岁的患者72例、年龄<60岁的32例,Lauren分型:弥漫型胃癌68例、肠型胃癌30例、混合型胃癌6例;(2)明确诊断为癌前病变的患者150例(癌前病变组),包括慢性浅表性胃炎30例、慢性萎缩性胃炎30例、肠化生30例、轻度异型增生30例和重度异型增生30例,其中男86例、女64例,年龄≥60岁的患者88例、年龄<60岁的62例。同时选取在六安市中医院进行体检的50例健康志愿者(健康组),其中男31例、女19例,年龄≥60岁的志愿者35例、年龄<60岁的15例。3组人员在性别、年龄等方面比较无统计学差异(P>0.05)。研究得到六安市中医院伦理委员会批准同意,同时所有入选患者均签署知情同意书。

1.2 入选和排除标准

(1) 入选标准 未接受化疗、免疫治疗等肿瘤治疗的参与者;胃镜检查前4周均无抗H.pylori治疗及服用非甾体抗炎药物史的参与者;所有参与者均符合《消化系统疾病的诊断与鉴别诊断》[9]中的消化道疾病诊断标准。

(2) 排除标准 资料不全的参与者;处于哺乳期的参与者以及孕妇;存在严重心、脑、肝、肾疾病的患者以及存在其他肿瘤的参与者;神智异常的参与者;不配合研究的参与者。

1.3 主要试剂

兔抗人CCR3多克隆抗体、兔抗人Cyclin D1多克隆抗体以及二抗由西格玛奥德里奇(上海) 贸易有限公司提供;Western blotting等相关试剂购自赛默飞世尔科技;二氨基联苯胺显色试剂盒由北京华英生物技术研究所提供;BCA蛋白定量试剂盒购自赛默飞世尔科技。

1.4 胃粘膜组织收集

所有入选者均进行胃镜检查,同时采集胃粘膜标本,包括病变处以及胃窦处2～3块,收集的新鲜组织立刻置于中性甲醛(体积比10%)中进行固定,常规石蜡包埋,然后进行切片(5 μm),接着进行HE染色,所有切片均由2名经验丰富的病理科主任医生进行复检。

1.5 免疫组织化学染色

取石蜡切片,在60 ℃条件下加温处理 80 min,然后进行二甲苯脱蜡、水化组织切片,接着进行高温高压组织抗原修复,随后滴加 3% 过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,磷酸缓冲盐溶液(PBS,phosphate buffer saline)清洗后分别滴加 20 μL兔抗人 CCR3多克隆抗体(体积稀释比例1∶200)和兔抗人 Cyclin D1 多克隆抗体(体积稀释比例1∶200),4 ℃条件下孵育过夜,PBS 冲洗后滴加生物素标记的二抗,37 ℃条件下孵育0.5 h,PBS 冲洗后,滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶复合工作液,37 ℃条件下孵育0.5 h,PBS 冲洗后进行二氨基联苯胺显色,苏木素复染,盐酸酒精分化,脱水封片。为减少实验误差,由六安市中医院2位经验丰富的病理科医生进行双盲阅片。在高倍视野下随机选取5个视野(每个视野观察不少于1 000个细胞),按着色强度记分:呈淡黄色者记为1分,即弱阳性;呈黄色者记为2分,即中等阳性;呈棕黄色者记为3分,即强阳性。按照阳性细胞数分:3分为平均阳性细胞数不低于50%;2分为平均阳性细胞数25%～49%;1分为平均阳性细胞数 5%～24%;0分为平均阳性细胞数低于5%。根据2个记分的乘积:7～9分为强阳性(+++)、4～6分为中度阳性(++)、1～3分为弱阳性(+)、0分为阴性(-)。

1.6 Western bloting检测

提取胃粘膜组织中的总蛋白,然后通过BCA蛋白定量试剂盒进行总蛋白定量。取50 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行转模以及封闭处理(体积分数为5%脱脂牛奶),然后分别加入兔抗人 CCR3多克隆抗体(体积稀释比1∶1 500)和兔抗人 Cyclin D1 多克隆抗体(体积稀释比1∶1 500),4 ℃孵育过夜并经Tris-吐温缓冲液(TBST,tris buffered saline tween)洗涤后进行HRP标记的二抗在室温孵育(60 min),TBST洗膜后进行化学发光法显影。利用全自动化学发光荧光图像分析系统和Image pro plus软件进行结果分析,确定CCR3和Cyclin D1相对表达水平变化。

1.7 H.pylori检测

采用13C 呼气试验进行H.pylori检测:检测前入选者需空腹不少于6 h,首先收集100 mL呼气,然后口服13C-尿素,再收集 100 mL待测气,然后连接13C红外线能谱仪检测孔,进行自动检测,以13C-尿素呼气试验超基准值(DOB,delta over baseline)>2.5为H.pylori阳性。

1.8 统计学分析

应用SPSS 22.0 统计软件进行统计分析。计数资料以n表示并采用卡方检验;计量资料采用x±s形式表示,多组间比较采用单因素方差分析进行;绘制受试者工作(ROC,receiver operating characteristic)曲线进行诊断分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果分析

2.1 CCR3和Cyclin D1在H.pylori感染所致胃癌及癌前病变中的表达情况

免疫组织化学染色显示,CCR3与Cyclin D1主要表达于胃粘膜上皮细胞和表层腺体,细胞膜为CCR3的主要表达部位,而Cyclin D1的主要表达部位为细胞质,呈广泛的黄褐色颗粒沉着。免疫组织化学染色结果见图1。 在这6种胃粘膜病变组织中,CCR3与Cyclin D1的表达阳性率和表达强度均随病变的加重而逐渐增加,比较存在显著性差异(P<0.05),CCR3与Cyclin D1表达情况见表1。Western blotting(WB)检测结果进一步表明,胃癌组织中CCR3表达水平显著高于癌前病变组织和正常胃粘膜组织(均P<0.05),同时胃癌组织中Cyclin D1表达水平显著高于癌前病变组织和正常胃粘膜组织(均P<0.05),WB检测结果见图2。

图1 免疫组织化学染色检测不同胃粘膜组织中CCR3与Cyclin D1表达和定位Fig.1 The expression and localization of CCR3 and Cyclin D1 in different gastric mucosa tissues detected by immunohistochemical staining

注:**表示和正常胃粘膜组织相比P<0.01;##表示和癌前病变组织相比P<0.01

表1 CCR3与Cyclin D1在H.pylori感染所致胃癌及癌前病变中的表达情况

2.2 CCR3和Cyclin D1表达与H.pylori感染胃癌患者临床病理特征间的关系

根据CCR3的WB检测结果的中位值,将104例胃癌组织平均分为2组:CCR3高表达组(n=52)和CCR3低表达组(n=52),CCR3表达水平和胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05),而与临床分期、浸润深度和分化程度显著相关(P<0.05)。根据Cyclin D1的WB检测结果的中位值,将104例胃癌组织平均分为2组:Cyclin D1高表达组(n=52)和Cyclin D1低表达组(n=52),CyclinD1表达水平与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小也无关(P>0.05),而与临床分期、浸润深度和分化程度显著相关(P<0.05)。结果如表3所列。

表3 CCR3、Cyclin D1表达与H.pylori感染所致胃癌患者临床病理特征间的关系[n(%)]

2.3 CCR3和Cyclin D1诊断H.pylori感染所致癌前病变情况

以癌前病变患者和健康志愿者CCR3与Cyclin D1做ROC曲线,结果如图3所示。CCR3曲线下面积为0.908(95% CI:0.868～0.947),以1.035作为临界值筛选癌前病变患者的敏感度和特异度分别为79.3%和88%;而Cyclin D1曲线下面积为0.819(95% CI:0.758～0.879),以1.9作为临界值筛选癌前病变患者的敏感度和特异度分别为54.3%和81%;CCR3与Cyclin D1联合筛选癌前病变患者的曲线下面积为0.948(95% CI:0.918～0.978),以0.373作为临界值时的敏感度和特异度分别为62.9%和76%。

图3 CCR3与Cyclin D1筛选H.pylori感染所致癌前病变的ROC曲线Fig.3 ROC curves of CCR3 and Cyclin D1 for screening precancerous lesions caused byH.pylori infection

2.4 CCR3和Cyclin D1诊断H.pylori感染所致胃癌情况

以胃癌患者和非胃癌患者的CCR3与Cyclin D1做ROC曲线,结果如图4所示。CCR3曲线下面积为0.689(95% CI:0.622～0.755),以1.86作为临界值筛选胃癌患者的敏感度和特异度分别为42.9%和90%;而Cyclin D1曲线下面积为0.696(95% CI:0.632～0.760),以1.275作为临界值筛选胃癌患者的敏感度和特异度分别为71.3%和80%;CCR3与Cyclin D1联合筛选胃癌患者的曲线下面积为0.746(95% CI:0.688～0.804),以0.373作为临界值时的敏感度和特异度分别为62.9%和76%。

图4 CCR3与Cyclin D1筛选H.pylori感染所致胃癌的ROC曲线Fig.4 ROC curves of CCR3 and Cyclin D1 for screening gastric cancer caused by H.pylori infection

3 结论

随着H.pylori研究的不断深度,多项研究表明H.pylori通过产生空泡毒素VacA、细胞毒素相关蛋白质CagA和尿素酶等致病因子而参与胃癌和癌前病变的发生[10-11]。H.pylori感染患者早期出现慢性浅表性胃炎,随着病情的不断加重,患者依次经历慢性萎缩性胃炎、肠化生、轻度异型增生、重度异型增生,最后发展为胃癌[12]。临床研究显示多数胃癌确诊时已为晚期,由于缺乏有效的治疗手段,晚期胃癌患者的5年生存率不足10%[13-15]。因此,对H.pylori患者进行有效的癌前病变及胃癌诊断将有助于患者的早期治疗和预后改善。因此,研究深入探究了CCR3和Cyclin D1在H.pylori感染所致胃癌及癌前病变中的诊断价值。

研究发现,CCR3与Cyclin D1主要表达于胃粘膜上皮细胞和表层腺体,细胞膜为CCR3的主要表达部位,而Cyclin D1的主要表达部位为细胞质。在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠化生、轻度异型增生、重度异型增生、胃癌这6种胃粘膜病变组织中,CCR3与Cyclin D1的表达阳性率和表达强度均随病变的加重而逐渐增加(P<0.05);同时胃癌组织中CCR3与Cyclin D1表达水平显著高于癌前病变组织和正常胃粘膜组织(均P<0.05)。对临床资料分析发现,CCR3与Cyclin D1的表达与胃癌临床分期、浸润深度和分化程度显著相关(P<0.05)。分析ROC曲线发现,CCR3与Cyclin D1在诊断H.pylori感染所致胃癌及癌前病变中具有较高的精度。

CCR3是G蛋白偶联受体中的一种,并且其已被证实可促进消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤等肿瘤的迁移和侵袭,和患者较差的预后相关。Cho等[16]的研究表明在结肠癌中,CCL7可通过激活CCR3促进肿瘤细胞的迁移和侵袭,并促进结肠癌细胞的EMT。而另有研究指出,在肾细胞癌、皮肤癌、恶性胶质瘤中,CCR3表达水平升高意味着更差的肿瘤病理学分级[17-18]。因此,胃癌及癌前病变患者CCR3表达水平存在异常表达。Cyclin D1既是一种细胞周期G1/S期转换的正向调节因子,又是一种G1期细胞增殖信号的关键蛋白,其在细胞增值过程中发挥着关键作用。多项基础研究发现,细胞周期G1/S期转换时间缩短与Cyclin D1过度表达有关,G1/S期转换时间缩短促进细胞周期转换速率,导致细胞增殖失控,从而发生癌变[19-20]。因此,Cyclin D1水平高低和癌症的发生存在密切关联。研究发现,在H.pylori感染所致胃癌及癌前病变黏膜组织中,CCR3与Cyclin D1表达水平均明显高于正常胃黏膜组织,且CCR3与Cyclin D1表达阳性率和表达强度均随病变的加重而逐渐增加,这与杨敏伟等[21]的研究发现相近。提示CCR3与Cyclin D1可能是胃癌及癌前病变诊断的理性标志物。

为进一步确定CCR3与Cyclin D1的诊断价值,研究分析了CCR3和Cyclin D1表达与临床病理资料的关系。结果显示,CCR3与Cyclin D1的表达水平均和胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小无关,而与临床分期、浸润深度和分化程度显著相关。研究发现,CCR3能够通过激活ERK-JNK信号通路而促进肿瘤细胞的生长和转移，从而加重临床分期和浸润深度[22-23]。Shan等[24]研究指出,Cyclin D1过表达促进了胃癌细胞的分化并导致患者较差的预后。进一步提示我们CCR3与Cyclin D1的表达和胃癌及癌前病变状态有关。Sungu等[25]研究显示Cyclin D1在甲状腺癌等肿瘤中展示了较高的诊断价值,而CCR3被认为是一种治疗和诊断新血管年龄相关性黄斑变性的靶点。因此,研究进行了ROC分析,分析结果显示CCR3与Cyclin D1对筛选H.pylori感染所致胃癌及癌前病变具有较高的精度,且二者联合的特异度更高。给予H.pylori感染患者CCR3与Cyclin D1检测将有助于临床医师判断患者疾病发展阶段,从而给予对症的治疗,提高患者治疗效果。

研究利用胃粘膜组织中的CCR3与Cyclin D1进行了H.pylori感染所致胃癌及癌前病变的诊断分析,然而对于血液中的CCR3与Cyclin D1的诊断价值未做探究,同时缺乏和非H.pylori感染所致的胃癌及癌前病变的对比。后续仍需扩大样本,通过检测血液中CCR3与Cyclin D1水平进一步深入探究CCR3与Cyclin D1在胃癌及癌前病变中的诊断价值。