膀胱癌组织中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p的表达变化及其意义

周文钧，黄国华，应巧，牟健

广安市人民医院，四川广安 638000

膀胱癌(BC)是起源于尿路上皮的恶性肿瘤，病理类型以膀胱移行细胞癌最为常见。世界范围内，每年新发病患者例数约40万例，近年随着我国人口的老龄化，BC的发病率及病死率逐渐上升[1]。BC的临床治疗方法包括手术、化疗及卡介苗生物治疗等，但因恶性程度高，即使经积极治疗仍可出现复发及转移，甚至危及患者生命[2]。非编码RNA(ncRNA)细胞内重要的RNA调控分子，包括长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)等，能够调控靶基因的转录、翻译及翻译后修饰，影响靶基因表达，不仅参与正常细胞的发育分化等生理学过程，还参与免疫、炎症及肿瘤等疾病的发生发展[3]。lncRNA MALAT1编码基因位于11q13.1，可充当核糖核蛋白复合物的分子支架发挥生物学功能[4]。lncRNA MALAT1在肾癌[5]、肝细胞肝癌[6]等肿瘤中存在异常过表达的现象，并能作为细胞迁移相关基因、周期调控相关基因的转录调控因子，促进肿瘤的增殖及转移。miR-146b-5p基因位于10q24.32，能够参与形成RNA诱导的沉默复合物，可通过碱基配对的方式识别结合下游靶基因mRNA，导致靶基因mRNA的不稳定。研究[7-8]发现，miR-146b-5p在胃癌、甲状腺癌等肿瘤中表达水平降低，其功能丧失能增加肿瘤细胞增殖、侵袭能力促进癌症进展。2015年7月～2020年6月，我们观察了BC组织中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年7月～2020年6月广安市人民医院收治的BC患者149例，男91例，女58例；年龄25～88(45.3±8.5)岁。纳入标准：①患者均为首次发现；②病理学检查确诊为BC；③以往未接受放化疗及靶向治疗等抗肿瘤治疗。排除标准：①同时伴有间质性膀胱炎、神经源性膀胱等疾病；②伴严重泌尿系统感染；③合并自身免疫性疾病或精神障碍性疾病。肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期105例，Ⅲ～Ⅳ期44例；病理分级：高分化59例，中低分化90例；病理类型：移行细胞癌129例，非移行细胞癌20例(鳞癌14例、腺癌6例)；肿瘤直径≤3 cm 100例，>3 cm 49例；有淋巴结转移68例，无淋巴结转移81例。手术留取BC患者新鲜肿瘤组织及癌旁正常组织(距离肿瘤边缘2 cm以上)各5 mg。本研究经本院伦理委员会审核通过，且所有患者对本研究知情同意并签字。

1.2 BC组织lncRNA MALAT1、miR-146b-5p检测方法 采用荧光实时定量PCR法。TRIzol法提取组织中总RNA，分光光度计检测组织中总RNA的浓度和纯度，OD260/OD280在1.8～2.1。以总RNA为模板，反转录合成cDNA。进行荧光定量PCR反应。反应条件：94 ℃、30 s，65 ℃、30 s，70 ℃、10 min，共35个循环。反应体系：2×SYBR Green remix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL和ddH2O 7 μL。以U6为内参，U6正向引物序列：5′-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；lncRNA MALAT1正向引物序列：5′-AGATTCCGTAACTTTA-3′，反向引物5′-AACACGTCTATACGC-3′；miR-146b-5p正向引物序列：5′-ATGCGCGCTGAGAACTGAATT-3′，反向引物5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以2-△Ct表示lncRNA MALAT1、miR-146b-5p的相对表达量。

2 结果

2.1 BC及癌旁组织中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p相对表达量比较 BC及癌旁组织中lncRNA MALAT1相对表达量分别为2.154±0.413、0.636±0.201，miR-146b-5p相对表达量0.509±0.122、1.255±0.360，两者比较，P均<0.05。

2.2 lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表达与BC临床病理特征的关系 结果见表1，由表1可知，lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表达均与BC淋巴结转移有关(P<0.05)。

表1 lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表达与BC临床病理特征的关系

2.3 BC组织中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表达的相关性 BC癌组织中lncRNA MALAT1、miR-146b-5p表达呈负相关性(r=-0.711，P<0.05)。

3 讨论

BC是泌尿外科常见的恶性肿瘤，全球每年死亡例数约20万例[9]。根据组织起源的不同，BC可分为尿路上皮癌、鳞癌及腺癌等，其中以尿路上皮癌最为常见。多种因素参与促进BC的发生过程，如遗传、环境及吸烟等因素均与BC的发生有关，特别是存在于烟草、化工原料等成分中化学致癌物，如芳香胺类化合物，能够激活HER-2、H-ras等原癌基因的表达，诱导膀胱上皮细胞发生恶变，引起肿瘤细胞生长失控[10]。此外，BC发生时涉及c-myc、c-fos等癌基因的过度激活及p53、PTEN等抑癌基因的失活，因此深入研究BC发生发展的分子机制，对于临床上寻找新的诊断治疗靶点具有重要临床价值。

lncRNA是长度200～300个核苷酸的分子，最初被认为是转录噪声，但随后研究表明其在肿瘤发生、转移和耐药性的形成等过程中发挥重要的生物学功能[11]。lncRNA MALAT1是一种普遍表达且高度保守的lncRNA，已被证明在肺癌、肝癌等人类恶性肿瘤中存在过表达现象，其能够作为分子海绵结合并抑制miR-375功能，进而促进下游癌基因YES相关蛋白1表达，导致肿瘤细胞的无限增殖及浸润转移，并且lncRNA MALAT1的高表达与肿瘤患者的不良生存预后有关，有可能是新的肿瘤诊断、治疗靶点[5,6,12]。本研究显示，BC组织中lncRNA MALAT1相对表达量明显高于癌旁组织，表明lncRNA MALAT1可能作为一种癌基因参与BC的发生发展。但lncRNA MALAT1表达升高的机制目前尚不明确，有研究报道肿瘤发生时细胞内存在内质网应激(ER)的现象，导致转录因子内质网细胞核信号1的表达，激活ER激酶信号通路，促进MALAT1的表达[13-14]。本研究还显示，lncRNA MALAT1表达与BC淋巴结转移有关，表明lncRNA MALAT1的高表达可能参与促进BC的淋巴转移。分析其原因，lncRNA MALAT1可以作为分子海绵结合miR-101-3p，促进血管内皮生长因子C(VEGF-C)的表达，而VEGF-C能够促进肿瘤的淋巴管生成，导致淋巴结转移[15-16]。lncRNA MALAT1还能够抑制β-连环蛋白的表达，导致Wnt信号通路的活化，促进Vimentin等间质性标志表达，使肿瘤细胞向局部浸润，侵犯淋巴管，导致淋巴转移[17]。

miRNA长度为19～22个核苷酸，其通过与靶基因mRNA的3′-非编码区(UTR)结合降低mRNA的稳定性，下调靶基因的表达。研究[18]发现，miRNA在心血管疾病、免疫性疾病及恶性肿瘤等疾病中均发挥重要的生物学调控功能，并影响疾病的发生发展。此外，不同肿瘤中及同一肿瘤中均存在多种miRNA的异常表达，形成调控肿瘤细胞生物学行为的复杂的网络，而检测肿瘤中miRNA的表达有可能成为肿瘤诊断及治疗的分子靶点[19]。miR-146b-5p基因位于人类10号染色体。研究[20]表明，胃癌组织中miR-146b-5p的异常表达降低能够促进肿瘤的增殖及迁移等生物学行为，是预测患者预后的独立危险因素。本研究显示，BC组织中miR-146b-5p表达明显低于癌旁组织，表明miR-146b-5p在BC中可能发挥肿瘤抑制的生物学功能，机制可能与lncRNA对miR-146b-5p的表达调控有关。双荧光素酶实验发现，lnc-AL445665.1能够直接结合miR-146b-5p的启动子区，抑制miR-146b-5p的表达，促进平滑肌瘤细胞增殖[21]。本研究还发现，miR-146b-5p的表达与BC淋巴结转移有关，提示miR-146b-5p低表达促进BC的淋巴结转移，其机制可能是miR-146b-5p通过抑制SWI/SNF相关蛋白5的表达，进而抑制转化生长因子β(TGF-β)信号通路的活化，而肿瘤发生时miR-146b-5p的低表达导致TGF-β通路的过度活化，促进肿瘤细胞的淋巴转移。本研究显示，BC癌组织中lncRNA MALAT1与miR-146b-5p表达呈负相关，机制可能是miR-146b-5p对lncRNA MALAT1表达存在负调控作用。

总之，BC组织中lncRNA MALAT1表达明显上调，而miR-146b-5p表达明显下调，两者均与BC患者淋巴结转移有关，有希望成为新的诊断和治疗BC的分子标志物。