仔猪肠道微生物早期定植特征及其调控的研究进展

左 斌，李 娜，王诗岚，韩丹丹，姜丽丽，王军军

（中国农业大学动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

仔猪出生时面临着一系列严峻的挑战，包括从相对无菌水生恒温环境转为有菌陆生变温环境、脐带血转为消化道营养供给、脐带血携氧转为肺部呼吸等变化，其消化和免疫等系统尚在发育初期，易受外界环境影响。因此新生期仔猪的健康是保证商品猪的存活率及后续生长发育的核心环节。仔猪的肠道健康是提高仔猪存活率及充分发挥仔猪生产潜力的重要决定因素，而肠道微生物与宿主的营养吸收和免疫耐受等生理过程息息相关。新生期仔猪的饮食和环境等诸多因素共同塑造肠道微生物的早期建立和平衡，并使其最终发育成一个种类繁多、数量庞大的微生物群落[1]。肠道微生物在新陈代谢和免疫耐受等众多生理过程中与宿主互利共生，生命早期良好的菌群结构有益于宿主的肠道健康，并对仔猪的后期生长发育产生积极影响[2]。因此，理解仔猪肠道微生物早期定植过程十分重要，在该阶段进行有效的干预能够提高仔猪的生长性能和存活率，减少养殖生产的经济损失，从而促进养猪业的健康发展。

1 仔猪肠道微生物早期定植过程

新生期是仔猪肠道微生物早期定植的主要阶段，日粮、母体和环境等来源的微生物与宿主相互作用，共同塑造仔猪早期的肠道菌群结构[3]。随着日龄的增加，肠道微生物的种类和数量也不断变化，微生物群落不断演替并逐渐趋于成熟[4]。通常认为，哺乳动物在胎儿时期处于无菌状态，而近年来此观点不断受到挑战，母仔间微生物垂直传递受到人们关注，肠道微生物早期定植是否始于胎儿期还有待进一步研究[5]。

1.1 胎儿期 研究表明，患有妊娠期糖尿病母亲所产新生儿的肠道微生物结构发生了明显改变，而且许多细菌在新生儿和孕妇多位点的变化趋势高度一致，可能是由于妊娠期糖尿病改变了孕妇的肠道菌群并垂直传递给了后代[6]。有研究在人类胎盘中检测到E.coli和梭杆菌属等微生物[7]，在新生儿的胎便中检测到高丰度的埃希氏菌属[8]，在剖腹产胎儿的脐带血中则分离出屎肠球菌、表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌等菌属[9]，这些发现支持了分娩前胎儿菌群的存在。而母鼠口服标记后的人体屎肠球菌，在胎鼠的胎粪和羊水中检测到该菌的存在[8-9]，揭示了母仔肠道微生物存在垂直传递。子宫菌群可能通过调节免疫细胞进而影响胚胎着床和组织形态，并对病原菌产生竞争抑制，防止子宫感染[10]。但目前尚不清楚这些微生物的来源以及迁移至子宫内的具体途径。

胎儿时期的细菌来源尚未确定，母体血液循环系统及阴道细菌可能是胎儿菌群的来源之一，胎盘传递或者羊水吞噬可能是胎儿肠道微生物的获取方式。然而，目前的相关研究仍存在杂菌污染、缺乏对照实验、人群样本有限等瓶颈[5]。Lim 等[11]利用qPCR 检测发现，足月胎儿羊水中的细菌16S rRNA 拷贝数显著低于粪便样本，略高于纯水样本，但与阴性对照（DNA 提取中用到的缓冲液）相比没有差异。利用二代测序分析也未发现羊水与阴性对照中的细菌OTU 数目存在显著差异，且羊水中几乎不含有DNA 和RNA 病毒[11]。因此，胎儿期是否存在菌群定植尚需进一步验证。

1.2 新生期 母猪分娩时，仔猪先后从母猪的产道、粪便及周围环境中接触各种微生物。此外，仔猪通过吮吸母乳及与母猪接触等方式获得母猪乳汁中及皮肤上的微生物，这些外源微生物是仔猪肠道中最初的定植者[12]。有研究发现，新生仔猪粪便的菌群结构与漏缝地板、母猪乳汁和乳头表面的菌群更加相似[13]；SourceTracker 分析表明，这些细菌来源多数是仔猪肠道内早期的过路菌，而母猪粪便细菌则更容易长期定植于仔猪的肠道内[13]。

外界微生物菌群在仔猪胃肠道内的定植顺序依次是需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌。刚出生时，乳杆菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属和肠球菌属等好氧菌和兼性厌氧菌最先定植于新生仔猪肠道内[4,14-15]。菌群结构初期以厚壁菌门和变形菌门为主[4,14]，在1～3 日龄埃希氏志贺菌属、链球菌属、肠球菌属和梭菌属等占主导地位[4,14,16]。肠道中的氧气被这些细菌消耗殆尽，为专性厌氧菌的定植和增殖提供了有利条件。随后，拟杆菌属、双歧杆菌属和梭菌属等专性厌氧菌逐渐在数量上占据优势，14日龄后瘤胃球菌属、布劳特氏菌属和普雷沃氏菌属等逐渐增多[4,15]。

Li 等[17]研究表明，仔猪不同肠段微生物呈现明显的分区定植规律，小肠菌群多样性较低，乳酸菌属、放线菌属、链球菌属和梭菌属等占主导地位，而大肠菌群多样性更高，并逐渐形成以乳酸菌属、拟杆菌属、普雷沃氏菌属和瘤胃球菌属等为主要优势菌属的微生物区系。随着日龄的增长，新生仔猪肠道微生物群落的多样性不断增加，菌群结构和功能逐渐趋于成熟[4,15,17]。肠道菌群建立过程中，不同种属的细菌在各个生长阶段的数量及比例不是恒定不变的，在新生期主要是能够利用乳汁内单糖和寡糖的细菌（如拟杆菌等）占主导地位[18]。肠道微生物在与宿主的相互选择和制约中，逐渐形成复杂稳定的微生物区系，最终构成一个功能统一协调的整体。

2 仔猪肠道微生物早期定植的影响因素

由于新生仔猪的生理特点和相对简单脆弱的肠道菌群结构，仔猪肠道微生物早期定植的过程易受多种因素影响。首先，作为宿主和肠道微生物的营养来源，日粮在菌群结构的塑造中起着决定性作用，微生物群落会随着宿主进食方式和营养成分的变化而不断改变；其次，肠道菌群建立的过程也是与宿主相互作用和选择的过程，宿主的遗传背景在一定程度上决定菌群的组成和结构；此外，宿主的生活环境特别是早期定植过程中的环境同样是影响肠道微生物的重要因素，在将来的研究中应受到更多重视。

2.1 进食 不同的进食方式和日粮组成对塑造仔猪肠道微生物的结构起着至关重要的作用。在进食方式上，代乳粉喂养的仔猪肠道菌群结构和代谢模式显著不同于母乳喂养的仔猪[19]；同时，代乳粉替代母乳喂养会增加仔猪肠道疾病的风险[20]。Frese 等[18]连续调查了从出生到7 周龄仔猪的肠道菌群变化规律，发现断奶前后由母乳到固体日粮的转变是导致仔猪肠道菌群结构变化的主要原因。Wang 等[21]也再次证明了日粮（尤其是玉米中性洗涤纤维）是塑造猪从出生到上市阶段肠道菌群的主要因素。值得注意的是，采食固体食物会对菌群结构产生巨大的影响。采食植物源性饲料后，植物多糖分解相关的菌属（如普雷沃氏菌属等）的相对丰度升高，碳水化合物利用和氨基酸合成等的功能基因增加，表现出菌群结构和功能对进食方式的适应性变化[22]。

母乳是新生仔猪的主要营养来源，乳汁中的低聚糖等营养成分通过调控细胞增殖和作为益生元等途径影响肠道发育，并对肠道菌群的早期定植有显著影响[23]。Bian 等[4]研究表明，母猪乳汁中乳糖、蛋白质和脂质的含量都对仔猪肠道菌群结构有显著影响，其中，乳杆菌属、拟杆菌属、瘤胃球菌属和粪肠球菌属等有益菌的相对丰度与乳糖含量呈正比，而与蛋白质含量呈反比，梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属和埃希志贺氏菌属等有害菌则相反。相比于母乳喂养，配合饲料喂养显著增加了新生仔猪结肠菌群中的链球菌属，降低了菌群多样性；而喂食乳制品的仔猪肠道中肠球菌属等增加，喂食大豆的仔猪肠道中则是瘤胃球菌数和梭菌属等增加[24]。除了母乳营养成分外，乳汁中含有的丰富微生物也会直接影响仔猪新生期肠道菌群的演替过程。盐单胞菌、芽孢杆菌和乳球菌属为乳汁微生物中的核心菌属[25]。在仔猪出生后35 d 内，在母乳、阴道、乳晕皮肤、母猪粪便和环境等微生物来源中，母乳微生物对仔猪小肠黏膜微生物定植的贡献度可达80%～90%，并一直持续到断奶后[25]。

2.2 遗传背景 研究表明，双胞胎的肠道菌群组成较无基因关联的2 个个体更为相似[26]，而同卵双胞胎肠道微生物的相似程度又要高于异卵双胞胎[27]，表明宿主遗传背景对肠道微生物具有重要影响。将长白猪和梅山猪的新生仔猪交叉寄养，发现相比于哺乳母猪的影响，品种对新生仔猪肠道微生物早期定植的影响更加显著，同时相比于长白猪，新生梅山猪肠道中乳杆菌属相对丰度更高，埃希志贺氏菌属相对丰度更低，具有更强的抗病能力[4]。

2.3 环境 环境同样是影响仔猪早期肠道菌群结构的重要因素。研究表明，同一窝仔猪的肠道菌群结构具有高度的相似性，这不仅是因为同窝仔猪具有相同的遗传背景，也与其相同的生活环境有关[28]。将同窝仔猪分别饲喂在哺乳母猪身边和人工喂养环境中，发现2 种饲喂环境下的仔猪肠道微生物呈现不同的发育模式[29]。相比于人工饲喂的高卫生条件，在母猪喂养的低卫生条件下的仔猪肠道微生物更具多样性，有益菌乳酸菌属数量显著增加，条件性致病菌数量显著降低，免疫系统发育也更加完善[30]，表明在相同的遗传背景下，环境可显著影响新生仔猪肠道微生物的早期定植。将来自不同窝的新生仔猪同栏喂养，发现同栏仔猪肠道菌群结构相似度比来自同一窝的仔猪更高，提示环境因素对仔猪肠道菌群结构的影响可能比遗传背景的影响更加显著[31]。

3 仔猪肠道微生物早期定植的调控方式

根据仔猪肠道微生物早期定植的规律和影响因素，将调控方式分为三大类。直接通过仔猪调控是采用新生仔猪母乳喂养配合教槽料的饲喂方式，直接给仔猪补充益生菌或益生元等以改善早期肠道微生物；间接通过母体调控则是根据母仔垂直传递的原理对母体肠道微生物进行调控，从而间接影响仔猪早期的肠道菌群；另外，还可以通过改变仔猪新生期的生活环境来调控其肠道微生物的早期定植。

3.1 直接通过仔猪调控 在实际养猪生产中，新生仔猪由母猪哺乳喂养，在7 日龄左右开始添加教槽料至断奶。教槽料能够帮助仔猪提前适应固体饲料，弥补生长过程中出现的母乳营养供给不足。因此，很多研究通过代乳粉饲喂、处理教槽料或者强制灌喂的方式干预仔猪肠道微生物的早期定植。

新生仔猪消化系统尚处于发育初期，无法迅速适应固体饲料，代乳粉配合益生制剂是有效的干预手段。用代乳粉替代母乳喂养会改变新生仔猪的肠道菌群，降低肠道细菌短链脂肪酸的产量；而在代乳粉中加入低聚果糖等益生元后，能够提高结肠内梭菌数量和回肠内乳酸菌数量，使得短链脂肪酸含量更接近母乳喂养仔猪[32]；低聚半乳糖能够在后肠中发酵，降低肠道内pH，增加盲肠食糜中丁酸含量，提高乳酸菌和双歧杆菌的相对丰度，从而改善肠道健康[33]。在代乳粉中加入短乳杆菌1E1 能够降低新生仔猪小肠食糜中大肠杆菌数量，提高小肠绒毛高度并促进肠道免疫系统发育[34]。

教槽料在新生仔猪的养殖实际中不可或缺，相比于代乳粉，教槽料更贴合生产实际情况。在教槽料中添加微生态制剂能够显著降低仔猪的腹泻率和死亡率，减少粪便中的大肠杆菌数量，提高乳酸菌数量[35]。在教槽料中分别添加益生菌、果寡糖或两者组成的合生元，能够改善仔猪肠道菌群的结构，其中果寡糖与合生元提高仔猪生长性能的效果更好[36]。可见，通过外源添加益生菌改善宿主肠道菌群时，配套的营养支持也十分重要。研究表明，拟杆菌株转入可利用紫菜聚糖的基因位点后，配合紫菜聚糖能够在含有不同肠道菌群的小鼠中成功植入，同时调节紫菜聚糖的喂食剂量可精细调控该菌株在小鼠肠道内的丰度[37]，这种靶向的膳食营养支持能够最大程度地支持外源菌株的定植并发挥其益生作用。然而，新生仔猪对固体饲料的消化率较低，常常导致消化不良和腹泻等，而且在研究中难以精确计算教槽料的采食量，因此无法根据益生制剂的摄入量评价其益生效果。

为达到量化益生制剂摄入量的目的，可采用强制灌喂的方式来干预新生仔猪肠道菌群的建立。将金华猪为供体的粪菌悬浮液喂服给三元杂交仔猪后，其结肠中的厚壁菌门和普雷沃氏菌科等的丰度增加，变形菌门和梭杆菌科等的丰度减少，平均日增重增加，腹泻发生率降低，肠道形态及紧密连接屏障得到改善[38]。灌喂粪肠球菌能够提高新生仔猪肠道菌群中厚壁菌门的丰度，提高日增重，降低腹泻[39]。灌服发酵乳杆菌能够提高新生仔猪肠道菌群中乳酸菌等有益菌的相对丰度，增强肠道屏障和机体免疫力[40-41]，且其灌服时间对其肠道菌群形成及代谢具有重要影响[42]。在不同日龄给新生仔猪灌服德氏乳杆菌菌液，可不同程度地提高其断奶时的个体均重和平均日增重，降低腹泻率和死亡率[43]。10 日龄前灌服、10 日龄后日粮添加乳酸杆菌可有效控制仔猪腹泻并且提高日增重，增加肠道内厌氧菌数量[44]。果寡糖作为一种双歧杆菌促进因子经常被用作益生元，在2～14 日龄给新生仔猪补充果寡糖能够改善肠道菌群结构，提高肠道免疫机能，改善肠道形态[45]。灌服由植物乳杆菌、麦芽糊精和果寡糖组合的合生元能够有效减少新生仔猪空肠和结肠内的大肠杆菌数量[46]。

上述研究结果表明，灌喂效果受使用菌株、干预时间及益生元的使用等因素的影响。通过直接引入外源菌株干预新生仔猪肠道微生物定植虽直观有效，但仍然伴随着仔猪应激大及人工成本高等问题，因此亟需进一步探索新的干预方式。

3.2 间接通过母体调控 母源微生物是仔猪肠道内最早的一批定植者，胎儿期可能存在的垂直传递以及仔猪出生后从母猪产道、乳汁、体表和粪便中接触到的微生物，都是仔猪肠道微生物早期定植的重要来源。虽然目前对母仔传递的具体机理和路径尚未完全了解，但通过母体调控新生仔猪的生长发育和肠道菌群定植的研究已有很多。

研究表明，母猪携带耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，所产仔猪携带该菌的几率比未携带母猪所产仔猪高12 倍[47]，提示母猪和仔猪之间存在微生物垂直传递现象。给妊娠母猪补充发酵乳制品后，所产仔猪肠道菌群的多样性增加，肠杆菌减少，有益菌定植增多[48]。在妊娠母猪及其所产仔猪的饮水和教槽料中添加益生菌制剂则能够有效降低仔猪的腹泻率和死亡率[49]。进一步研究发现，饲料添加粪肠球菌后妊娠母猪粪便中乳酸菌数量增多，其后代仔猪肠道菌群区别于其他母猪子代，这可能来自母猪粪便微生物的影响[50]。在母猪饲料中添加粪肠球菌能够提高其乳汁中乳糖含量，降低体细胞数，同时改善哺乳仔猪的肠道菌群，增强其肠道免疫[51]。在产后7 d 内泌乳母猪乳头上涂抹、8～35 日龄在仔猪饲料内添加液态益生素，可显著提高仔猪在哺乳期和断奶期的日增重，并降低腹泻率[52]。给妊娠母猪补充2%可溶性纤维（糊化糯玉米淀粉+瓜尔胶）也可显著增加后代仔猪肠道乳酸菌数量，降低嗜胆菌属数量，并改善生长性能，降低肠道通透性[53]。

间接通过母体干预新生仔猪肠道菌群的途径非常多，而对出生前胎猪在母体子宫内的微生物传递还缺少研究。如果能在仔猪出生前就开始建立健康菌群，对仔猪应对出生后的复杂环境将大有裨益。

3.3 间接通过环境调控 环境同样是塑造宿主肠道菌群的重要因素，提示改变仔猪生长环境是另一种有效的干预方式。改变仔猪出生后24 h 的环境能够显著影响仔猪新生期甚至断奶期的肠道菌群结构，肠道微生物影响下的代谢通路表达也呈现出较大差异[54]。将具有相似遗传背景的仔猪饲养在舍内和舍外的不同环境中，舍外仔猪回肠菌群以厚壁菌门特别是乳杆菌属为主，而卫生条件较好的舍内仔猪回肠菌群中乳杆菌属相对丰度较低，潜在致病菌增多，免疫机能较差[55]。此外，使新生仔猪接触表层土可加快其肠道菌群成熟过程，表现为肠道内与饮食转换（从母乳到植物为主的饮食）相关的菌种相对丰度更高，断奶后仔猪肠道内植物源饲料分解相关的普雷沃氏菌属和厚壁菌门的许多成员在饮食转换过程中显著富集，生长性能也优于早期未接触土壤的仔猪[56]。通过类似引入表层土的方式改变新生仔猪的生活环境，成本较低，操作简易，便于在实际生产中的应用，但其干预路径和机制还有待进一步探究。

3 结 语

新生仔猪肠道微生物定植是一个渐进过程，受日粮、母体、基因型和环境等多种因素的影响，生命早期建立良好的肠道菌群不仅有利于新生期的健康成长，更对后期的生长发育有积极的影响，探究这一阶段的有效干预方式十分重要。对新生仔猪肠道菌群建立过程的干预效果受到干预方式、干预时间和引入菌种及益生元等多种因素的影响。直接通过仔猪调控的干预方式直观有效，便于理论研究的量化分析，但难以在实际生产中推广；间接通过母体和环境的干预方式便于在生产实际中应用，但其具体路径和机理还有待进一步研究。实际生产中母乳是仔猪的主要食物来源，肠道中的微生物同样依赖于母乳中的营养生存繁殖，所以在选择引入的益生菌株时需考虑其是否能够有效利用母乳中的营养成分以及菌株与宿主之间的互作。同时，配合使用益生元来帮助益生菌在仔猪肠道内有效定植，能更有效地改善菌群结构和生长情况。新生仔猪肠道微生物早期定植对仔猪早期的营养吸收和免疫系统发育也具有重要作用，开发直接有效的干预方式将对养猪业发展具有巨大的推动作用。