猪的冷冻精液研究进展

2020-12-17范文博

黑龙江动物繁殖 2020年2期

范文博，刘娣

（黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨150086）

冷冻精液保存是人工授精技术最重要的环节。研究者对猪冷冻精液保存进行了大量研究，有许多问题制约着这项技术的推广应用，如质膜完整性差及线粒体活性低等。这些因素会在冷冻过程中显著降低精子品质。因此，有必要对猪精液冷冻保存的研究现状、猪精子的冷冻特点与原理、猪精液稀释液及存在问题进行综述，为促进猪冷冻精液人工授精技术的生产应用提供理论和实践基础。

1 猪精液冷冻保存的研究概况

早期猪冷冻精液技术发展比较缓慢，存在各种技术的局限，直到1956年英国学者C.Polge进行首次尝试，将猪冷冻精液用于人工授精，从此推动了冷冻精液技术的发展。之后其他发达国家也开始了猪冷冻精液技术的探索。经过大量试验发现，猪冷冻精液技术存在很多难题，包括质膜完整性、线粒体活性和DNA完整性在冷冻过程中都会降低，最终会影响精子的品质［1］，这就使得猪人工授精技术的发展受到局限，也限制了冷冻精液的商业化生产与应用［2］。

国内对冷冻精液的研究相对缓慢，从1975年开始对猪精液冷冻技术进行研究，但一直没有突破性进展。1990年开始，研究人员在稀释液、冷冻保护剂、冻精剂型、解冻液等方面取得了一些成果，但精子损伤、冷冻-解冻机制等多方面尚不完全清楚，仍处于摸索阶段［3-4］。在近几年的研究中发现，添加抗氧化剂［过氧化物酶、谷胱甘肽、维生素E及植物性抗氧化剂（如红景天多糖、芝麻酚、黄芩素）］有助于猪精液冷冻保存。但是单单添加这些抗氧化剂还不足以弥补冷冻精液和新鲜精液的差距［5］。目前猪人工授精中使用冷冻精液的比例还很少。

近几年的研究表明，为提高精液品质，精液冷冻保存研究可以从以下两方面着手，一是防止冰晶和高渗区的形成，二是防止氧化损伤。

2 猪精子的冷冻特点与原理

2.1 猪精子的冷冻特点

猪一次射精量大但密度偏低，精子对环境温度变化非常敏感，在迅速冷却时容易失去活力，这种现象在采集精液后温度迅速冷却到15，5，0℃时最为严重，表现为解冻之后精子活力降低、顶体膜损伤、精子膜的选择通透性降低等，可以通过改变精子膜上胆固醇和磷脂的比例、烃链的饱和程度、蛋白质和磷脂的比例等改善精子抗冷休克的能力。

2.2 猪精子的冷冻原理

猪精子主要是在液氮（-196℃）或干冰（-79℃）中保存。通过设定好步骤控制降温速度，使精子缓慢降温，最终将精子放置于液氮或干冰中，降低精子的代谢速率或者使代谢完全终止，得以长期保存［6］。液氮比干冰成本低，应用更为广泛。随后经过解冻，精子活率得以恢复，可以进行相关的试验。在整个冷冻过程中，精子会遭受物理损伤、化学损伤、氧化损伤［7］。物理损伤是指在冷冻过程中细胞内外先后形成的冰晶对精子细胞膜和细胞内部造成的损伤，首先在细胞外形成冰晶，细胞内为正常状态，若温度降低过快则导致细胞内水分不能及时渗出，在细胞内形成冰晶，损伤细胞。冰晶在精子形成过程中是不可避免的，损伤程度也与冰晶形成的大小有一定的关系。为了减少冷冻过程中冰晶对精子的损害，应尽可能使冰晶维持在微晶状态，从而提高精子活率。化学损伤是由于细胞外的溶液遇冷先凝结，使得细胞外渗透压升高，从而使得精子细胞膜内外渗透压不平衡。若细胞长时间处于这种状态会引起精子失水，失水过多会造成精子死亡，从而降低精子活率。渗透压的改变对精子造成的损伤称为化学损伤［8］。氧化损伤是在精子冷冻过程中温度的改变使细胞产生氧化应激反应，产生活性氧。活性氧是精子正常代谢产物，处于动态平衡，并发挥第二信使的作用，帮助精子细胞内进行正常的生理反应。在冷冻-解冻过程中精子会产生大量活性氧，冷打击造成氧化胁迫和活性氧的产生，破坏自身的动态平衡。活性氧使得精子细胞膜上的不饱和脂肪酸发生氧化反应，从而破坏精子结构的完整性，造成精子死亡，降低精子活率。同时，抗氧化剂的添加使得精子在冷冻过程中适应性增强，需要寻找一种对精子无毒和具有保护作用的抗氧化剂来提高解冻后的精子品质，此方面研究具有重大的研究价值。

3 猪精液稀释液的研究

现阶段猪冷冻精液技术主要包括以下几个步骤：采集猪精液、鉴定精液品质、精液稀释液的配制、精液的稀释方法、精液的冷冻、精液的解冻。猪精液稀释液的配制是非常重要的环节。

3.1 猪精液稀释液的基本组成

猪精稀释液是由冷冻保护剂、缓冲液［包括柠檬酸钠、磷酸盐、乙二胺四乙酸（EDTA）］、蛋白质、糖类、脂蛋白及添加剂等多种成分组合而成［9］。

冷冻保护剂是在冷冻时保护细胞，避免细胞受到超低温伤害的化学物质。冷冻保护剂通过减少物理性损伤和增加溶液黏度提高冷冻效果。冷冻保护剂分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂是指小分子物质进入细胞内，通过置换细胞内水分调节渗透压，主要保护细胞内部。最常用的渗透性冷冻保护剂是甘油，甘油可以减少精子在冷冻、解冻过程中受到的伤害。甘油在溶液中容易结合水分子发生水合作用，使得溶液的黏性增加，减少了冷冻时水的结晶，从而达到保护精子的作用；但需要注意的是，甘油对精子顶体有严重损害，会对精子细胞膜造成伤害［10］。不同动物需要的稀释液中甘油浓度是不一样的，现在配制猪冷冻稀释液时大多使用3%甘油。研究表明，甘油浓度为2%～4%时平衡60 min，冷冻复苏后精子活力最高［11］。非渗透性冷冻保护剂一般为大分子溶于水的物质，通常无法进入细胞内部，因此又被称作细胞外冷冻保护剂。目前的研究中，非渗透性保护剂聚蔗糖、蔗糖和海藻糖对猪精液冷冻保存具有良好的效果。

果糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖等糖类都可用于家畜精液的冷冻保存，其中效果最好的是果糖［12］。但在生产中，由于果糖价格较高，使用者只能适当添加，大多使用价格便宜的葡萄糖或蔗糖。在研究猪冷冻精液稀释液的过程中发现，糖类的添加不是越多越好，加入2% ～4%葡萄糖精子状态最佳；经过反复试验得出，葡萄糖和乳糖浓度都在2%～3%混合使用效果极佳；将0.05%可溶解性氮-乙酰-D-氨基葡萄糖的稀释液用于猪冷冻精液，可以明显提高解冻后精子活力和顶体完整率［13］。

卵黄对精子也有保护作用，卵黄中含有的脂蛋白、卵磷脂类物质可以预防精子发生冷休克。卵黄中的胆固醇与精子活力有关，有助于精子存活。此外，卵黄可有效减少高渗性的糖和盐溶液对精子的损伤。稀释液中卵黄浓度以10% ～20%为宜，加入后应充分混匀。需要特别注意的是，在有氧条件下卵黄中某些氨基酸经酶系统的作用可能产生对精子有害的过氧化氢，因此稀释液必须现用现配。

众多试验结果表明，在猪精液中加入生殖激素、抗生素、细胞因子、咖啡因、生殖激素、氨基多糖、乙酮可可碱等可以使猪精液中的精子存活时间更长，还可以增加精子活力［14］。抗氧化剂是猪精液稀释液中的重要组成成分，但研究发现天然无毒的抗氧化剂对冻精品质的提升程度有限。应根据需要提升的方面不同开发不同种类的抗氧化剂，这也是目前猪冻精技术的研究热点之一。

3.2 猪冷冻稀释液的配制方法

常用的精液稀释法主要分为两种，分别是一次稀释和二次稀释。一次稀释法较为简单，可直接按照相应比例把精液和含甘油的稀释液均匀混合，再进行冷冻［15］。二次稀释法则稍繁琐，先把不含甘油的稀释液Ⅰ与等体积的精液混匀，经过60～90 min逐渐降温，使混合液温度降到5℃；再与稀释液Ⅱ（即冷冻液，含甘油）进行等体积混合，在5℃条件下静置5 min，使精液与甘油充分混匀，然后可以进行冷冻。

3.3 常用的冷冻稀释液配方

目前在精液冷冻-解冻中使用最为广泛的稀释液是贝滋维尔溶解液（beltsville thawing solution，BTS），配方为EDTA 0.125 g，柠檬酸三钠0.6 g，氯化钾0.075 g，碳酸氢钠0.125 g，葡萄糖3.7 g，青霉素钠0.06 g，硫酸链霉素0.1 g，纯化水100 mL［16］。其中葡萄糖主要用于为精子代谢提供能量，维持正常的生理活动；EDTA是金属离子螯合剂，避免金属离子引起精子的过氧化损伤；柠檬酸三钠具有缓冲作用，维持溶液的酸碱平衡；青霉素钠和硫酸链霉素主要用于抗菌，精子起初没有细菌，但由于采精时操作不当或者是工具不洁净都能造成污染；BTS为基础稀释液，根据后加入物质的不同会导致精子各项指标不同。下面介绍二种较好的稀释液配方。配方1：葡萄糖2 g，乳糖3 g，甘氨酸0.8 g，柠檬酸三钠0.3 g，青霉素0.03 g，链霉素0.05 g，纯化水100 mL，20%卵黄，3%甘油［17］。应用此配方后精子活率（33.0±1.2）%，顶体完整率（59.7±2.2）%。配方2：葡萄糖2.5 g，乳糖3.5 g，青霉素0.06 g，链霉素0.1 g，纯化水80 mL，OEP（一种含有十二烷基硫酸钠的复合物）0.5 mL，20%卵黄，3%甘油［18］。应用此配方后精子活率（30.22±1.97）%，顶体完整率（39.41±1.60）%。

目前还没有一种占据绝对核心地位的猪冷冻精液稀释液配方，这也是目前猪冻精技术研究的热点之一。