基于网络药理学分析达明饮治疗糖尿病视网膜病变的作用机制研究

孙河，杨稀瑞，董霏雪，张雪松，王继雪

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病引起的微血管病变之一[1]。目前已成为全世界中青年人群主要致盲原因[2]。血糖的持续升高，引起体内血糖代谢发生紊乱，导致多元醇通路及氧化应激反应等出现异常，是本病的主要致病因素[3]。西医用于治疗DR 的药物有限，多在控制血糖的基础上，使用羟苯磺酸钙、蛋白激酶C 阻断剂、糖皮质激素、血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制剂等。糖皮质激素虽可抑制VEGF 过度表达，紧凑毛细血管内皮细胞，调节血视网膜屏障，但长时间激素治疗会带来诸多不良反应，如眼内压增高、白色晶状体形成及炎症等；蛋白激酶C 阻断剂可有效阻断VEGF 受体，但会出现恶心、腹泻症状[4]。中医药疗法在治疗DR 方面优势明显，通过辨证论治，因方施药，效果明显，已逐步成为防治DR 进展不可或缺的重要组成部分[5]。

达明饮是黑龙江中医药大学孙河教授自拟方剂，主要由三七、蒲黄、黄精、黄芪、川芎、女贞子等组成[6]。方中三七味微苦、甘，性温，归胃、肝经，活血定痛化瘀；蒲黄味甘，性平，归肝、心包经，功效为止血、化瘀；黄精性平，味甘，归脾、肺、肾经，具有补气养阴、润肺、健脾、益肾之功；黄芪味甘，性微温，归脾、肺经，补气固表；川芎性温，味辛，归肝、胆、心包经，活血行气效果显著，且能疏通上述诸药之药性；女贞子性平，味甘、苦，归肝、肾二经，有补益肝肾、清热明目等功效，同时具有降低血糖的作用；诸药合用，共奏益气养阴，活血化瘀，通络明目之功，可改善视功能。

现代药理研究[7]表明，达明饮可通过降低血液黏稠度、扩张眼底血管、增加血流量、改善视网膜血供，达到防护视网膜及眼底血管的目的。由于DR 的病理机制复杂，且达明饮作为自拟方剂，药效物质基础及药理机制尚不明确，故系统地研究达明饮治疗DR 的生物活性成分和分子作用机制，有利于为临床用药提供依据。网络药理学基于系统生物学理论，通过建立药物与相关靶点、疾病与治疗靶点间的关系进行模型预测，整合两者的作用网络，分析药物在各网络模块中与特定节点间的联系，系统、整体地探究相关药物与潜在靶点间的关系[8]。本文基于网络药理学，对达明饮进行科学的阐释，为临床推广本方提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 化学成分检索

通过TCMSP 数据库，分别以“三七”“蒲黄”“黄精”“黄芪”“川芎”“女贞子”作为检索词，查找各中药的化学成分。选取同时满足口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30.00%且 类 药 性 （drug like，DL）≥0.18 作为筛选条件。

1.2 药物靶点预测

基于TCMSP 数据库，将达明饮的有效化合成分依次匹配潜在的靶点基因；同时，结合蛋白质数据库获取与所选化合物相关的蛋白靶点，使用TCMSP 数据库进行相关靶点的筛选。

1.3 确定DR 的相关靶点

从Gene Cards 数据库和OMIM 数据库中以“diabetic retinopathy” 作为关键词检索与DR 相关的疾病靶基因。建立Excel 表格，将相关靶点基因依次录入，并以此作为分析达明饮中药活性成分治疗DR的潜在作用靶点。

1.4 构建化合物活性成分-作用靶点网络

将达明饮中有效活性成分与治疗DR 的作用靶点同时导入Cytoscape3.7.1 软件，构建活性成分-作用靶点网络。

1.5 核心靶点相互作用网络的构建与分析

将达明饮治疗DR 的潜在靶基因导入String 数据库，并限定物种为“Homo sapiens”，检索得到靶标-蛋白相互作用关系，以TSV 格式进行保存。将TSV文件再次导入Cytoscape3.7.1 软件，用Network Analyzer 工具进行网络分析，获取Degree 值。通过Cytoscape3.7.1 软件绘制蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，将所绘制的PPI 网络图保存为“.png”格式图片。

1.6 生物学过程及通路分析

将达明饮中各中药成分靶点基因Uniprotkb 导入DAVID 数据库，形成基因列表，对该表进行基因功能国际标准分类体系（gene ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书 （kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。选取错误发现率（false discovery rate，FDR) 值＜0.05 的通路，使用OmicShare 网站绘制气泡图。

2 结果

2.1 达明饮活性化合成分与靶点

共检索获取三七化学成分119 个、蒲黄化学成分33 个、黄精化学成分38 个、黄芪化学成分87 个、川芎化学成分189 个、女贞子化学成分119 个。以OB≥30.00%且类药性DL≥0.18 作为限定，筛选出符合条件的活性成分三七8 个、蒲黄8 个、黄精12个、黄芪20 个、川芎7 个、女贞子13 个，选择OB 值排名靠前的5 位化合成分进行数据展示（表1）。

表1 达明饮活性成分

2.2 靶点预测

在Uniprot 数据库中输入相应靶蛋白，获取119个靶点相应基因。将获取的靶基因与GeneCards 和OMIM 数据库中检索得到的有关DR 的相关基因进行比对，筛查出可能与DR 相关的靶点，共41 个（表2）。

2.3 活性成分-靶点网络

本网络共有288 个节点，化合物节点250 个，靶点节点38 个、543 条边，达明饮复方中Degree 值排名前6 的主要化合物为槲皮素、山奈酚、黄芩素、木犀草素、薯蓣皂素、β-谷甾醇；每条边都代表着化合物与靶点之间的直接联系；不同靶点可能对应相同活性成分，单一靶点也可与不同活性成分相对应（图1）。

2.4 核心靶点相互作用网络

将2 个数据库所获得的DR 靶点进行交集，再与达明饮的中药有效活性成分的作用靶点进行交集处理，最终获得达明饮治疗DR 的关键靶点41 个（图2）。将41 个潜在靶点输入String 数据库，限定物种为“Homo sapiens”，获取蛋白相互作用关系，使用Cytoscape3.7.1 软件绘制相互作用网络。如图可见，本网络共包含41 个节点，208 条边。图中节点表示蛋白，边则表示蛋白之间的关联性。Degree 值排名靠前的蛋白，依次为IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR、ESR1（图3）。

2.5 GO 功能富集分析

通过DAVID 注释平台对达明饮PPI 网络中靶点蛋白在基因功能的作用下进行分析，并筛选出基因数10 个以上者，分别为生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）（图4）。其中BP 包括转录因子活性、直接配体调节序列特异性DNA 结合、类固醇激素受体等；CC 包括酶激活剂活性、核受体活性等；MF 包括DNA 结合转录激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、蛋白质异二聚化活性（表3）。

2.6 KEGG 通路富集分析

通过DAVID 数据平台进行KEGG 通路富集分析，对达明饮PPI 网络中蛋白在信号通路中的作用进行相应分析，共得到113 条信号通路，依据P＜0.05且FDR＜0.05，筛选出10 条主要作用的信号通路。包括凋亡信号通路、磷酯酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、低氧诱导-1 信号通路、JAK-STAT 信号通路、Ras 信号通路、NF-KB 信号通路、血管内皮生长因子信号通路（图5，表4）。

表2 靶点预测信息

图1 达明饮化合物-靶点网络图

图2 达明饮-DR VENN 网络图

表3 “达明饮-DR”GO 生物过程分析

图3 达明饮-DR PPI 网络可视化图

图4 达明饮治疗DR 潜在靶点的GO 功能分析气泡图

图5 达明饮治疗DR 潜在靶点的KEGG 靶点通路柱状图

表4 达明饮KEGG 靶点通路富集结果

3 讨论

中医将DR 归属于“消渴目病”范畴，久病致肝肾亏虚、精血不能上承于目，发为本病。孙河教授通过多年临床经验总结发现，DR 的诱因不外乎出血与瘀血，治疗应抓主要病因病机，结合局部症状，整体辨证施治。本研究是从网络药理学方面分析达明饮治疗DR 的分子作用机制，从药物有效成分-疾病-关键靶点网络中发现，达明饮中槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素、山奈酚、木犀草素等成分Degree 值较高，提示上述药物成分可能与DR 治疗密切相关。现已证实，槲皮素具有抗炎和神经保护作用，可通过VEGFR-2 受体靶向调节ACP/MTOR/P70S6K 通路，抑制体内蛋白激酶C、ERK1/2 和细胞溶质C 磷酸化，保护血-视网膜屏障免受新生血管的刺激[9-11]。β-谷甾醇具有调节脂质代谢的作用、保护血管内皮细胞、降低血清胆固醇和甘油三酯水平、促进转运及清除、对抗血小板凝集起到保护作用[12]。研究[13-14]发现，黄芩素对DR 患者血管通透性具有神经保护作用；此外，黄芩素还可降低DR 小鼠视网膜中活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水平和NADPH 氧化酶2 的表达，对DM 小鼠的视网膜具有抗炎、抗氧化及抗渗透作用。山奈酚可通过抑制VEGF-2 的过表达，延缓眼底新生血管的形成[15-16]。此外，现代研究[17]证实，木犀草素对VEGF 诱导的血管生成起到抑制作用，表明木犀草素可抑制视网膜新生血管生成。以上诸多报道均与本研究得到的结果得到相互验证，证明达明饮治疗DR 分子机制的科学有效性。

通过分析发现，靶蛋白IL-6、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR 在PPI 网络中的Degree 值较高，表明达明饮可能通过以上靶蛋白治疗DR。IL-6 作为一种炎症细胞因子，主要作用于机体炎症的调节方面[18]，研究证实，增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR） 的发生与免疫应答相关，在PDR 患者玻璃体中检测出浓度较高的IL-6；表明炎症免疫过程在PDR 中意义重大[19-20]。WU 等[21]报道，VEGFA 在PDR 中具有上调作用，实验证明在PDR 小鼠模型中下调VEGFA 水平可抑制视网膜中新生血管形成。OTANI 等[22]研究发现，肾素-血管紧张素系统与DR 新生血管形成有关，通过PKC 和MAPK 信号途径介导，AngⅡ可刺激视网膜血管内皮细胞生成素mRNA 表达。WILSON 等[23]报道，MAPK 参与细胞外基质的降解，促进DR 新生血管形成。KUMAR 等[24]用槲皮素治疗DR 大鼠，其体内Caspase-3表达明显下降，提示Caspase-3 可通过网膜中的Bdnf-trkb/aktsynaptophysin 信号通路发挥潜在的抗凋亡作用，保护视神经损伤。Sebastian 等[25]发现EGFR 是广泛分布于细胞膜的多功能跨膜糖蛋白，其配体与EGFR 结合，可激活调节基本细胞活动的信号通路。PARK 等[26]发现，EGFR 受体对视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE） 和Müller 细胞的迁移和增殖具有调节作用。由此可见，网络药理学的结果与上述结果相一致，表明达明饮可通过对以上蛋白的相互调节，从而影响DR 发生发展全过程。

通过GO 富集分析可知，达明饮治疗DR 涉及DNA 结合转录的激活、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、蛋白质异二聚化活性、近端启动子序列特异性DNA 结合、酶激活剂活性、染色质结合、核受体活性、转录因子活性、直接配体调节的序列特异性DNA 结合、类固醇激素受体、酰胺键合等途径。KEGG 通路富集分析提示，达明饮的关键靶点基因富集与DR 密切相关的通路上，本方主要与Apoptosis、AGE-RAGE、PI3K-Akt 等通路有关。Wu 等[27]发现，AGE-RAGE 信号通路可以激发氧化应激和炎症反应，持续高血糖状态下，刺激RPE 细胞、AGE-RAGE 信号被激活，导致视网膜视觉微循环功能障碍。Fletcher 等[28]发现，DR 的发生发展与视网膜毛细血管周细胞、内皮细胞及神经细胞的凋亡有关。汪东生等[29]研究认为，长期处于高糖环境下，视网膜细胞可见NF-κB 和Caspase-3 活化。由于DR 容易产生炎症反应，造成眼底微循环障碍，故达明饮可通过抑制炎症反应发展、改善眼底微循环。

PI3K/Akt 信号通路可使视网膜内皮细胞出现增殖、存活，抑制细胞凋亡[30]。DR 发生时体内会出现低氧和高血糖，造成VEGF 过度表达，通过KDR 和FIT-1 受体，诱导PI3k/Akt 信号通路，加速内皮细胞迁移、增殖，形成微血管腔，导致眼底新生血管形成[31]。Xie 等[32]发现，VEGF 通过激活下游PI3K/Akt信号级联分子，抑制内皮细胞凋亡，促进内皮细胞增殖和血管新生。Zdychova 等[33]认为，PI3K/Akt信号通路对内皮细胞的血管发生、增殖、微血管通透性、存活、细胞转化和胚胎发育发挥重要作用。因此，达明饮可能通过调节视网膜内皮细胞的凋亡途径、抑制新生血管生成，来达到防治DR 的作用。

综上所述，通过对达明饮所含化合物、靶点、作用通路等进行GO 分析与KEGG 分析，初步验证出本方治疗DR 的药理机制，为后期进一步研究本方的机制提供有价值的科学参考。