组蛋白去甲基化酶5的结构、功能及其抑制剂研究进展

唐凯，左佳辉，余斌，刘宏民

（郑州大学药学院，河南 郑州 450001）

大多数蛋白在经过转录翻译后往往需要经过合适的折叠及翻译后修饰（post-translational modification，PTM）才能够行使正常的生物学功能，其中组蛋白修饰作为表观遗传学的重要调节机制，主要包括甲基化、乙酰化、泛素化以及磷酸化等，这些修饰既可以单独发挥作用，也能够通过相互协同的方式共同调节基因的表达[1]。而组蛋白的甲基化修饰是一个包括催化甲基化和去甲基化的可逆过程，主要发生在尾部的赖氨酸和精氨酸残基上，它在染色质形成、X染色体的失活、基因的转录调控等方面发挥着重要作用，与肿瘤、免疫、衰老等多种生理过程都有密切关系[2]。1999年，Agaard等[3]发现了组蛋白甲基转移酶， 2004年，哈佛大学Yang Shi教授课题组首次发现了赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine specific demethylasesz 1，LSD1），证实了组蛋白的甲基化是一个可逆过程[4]；截至目前，已有多个课题组报道了组蛋白去甲基化酶Jumonji C（JmjC）家族[5]。随着研究的不断深入，组蛋白的甲基化修饰过程中未知的问题逐渐被人们揭开。

组蛋白去甲基化酶5（lysine-specific demethylases 5，KDM5）是JMJD（jumonji domain containing）家族中重要的一员，通过特异性去除组蛋白3第4位赖氨酸（H3K4）甲基化修饰，参与表观遗传调控过程，与肿瘤、免疫、耐药等疾病的发生发展有密切关系[6-8]。作为一个潜在的肿瘤治疗靶标，KDM5的生物学功能及其抑制剂开发已成为肿瘤生物学和抗肿瘤靶向药物研发领域的热点问题。本文主要针对KDM5的结构、生物学功能及代表性抑制剂展开综述。

1 组蛋白去甲基化酶的肿瘤生物学功能

组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶可分为黄素腺嘌呤二核苷酸辅酶（flavin adenine dinucleotide，FAD）依赖的单胺氧化酶LSD1和包含JmjC结构域的JMJD蛋白家族。LSD1特异性去除H3K4、H3K9单双甲基化，进而激活或抑制基因表达[9]；而JMJD家族蛋白包括KDM2A/B、KDM3A/B、KDM4A-E、KDM5A-D、KDM6A-B、KDM8等多个亚家族，选择性催化不同底物（见图1a）[10]，JMJD家族蛋白JmjC结构域高度保守，由2个组氨酸 (His)和1个谷氨酸 (Glu)组成（见图1b）。

KDM5的去甲基化机制如图2所示，主要依赖Fe2+和α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）催化H3K4去甲基化修饰。首先它可以特异性识别三甲基化修饰的赖氨酸（H3K4Me3），继而在O2的参与下，通过α-KG和Fe2+的氧化，无需氢供体即可催化组蛋白甲基赖氨酸生成不稳定的羟基化中间体（甲醇胺），同时伴随产生琥珀酸和CO2；甲醇胺中间体进一步水解生成二甲基化状态赖氨酸（H3K4Me2）和甲醛。KDM5继而催化H3K4Me2的去甲基化过程也是以同样的方式进行[11]。

在JMJD家族中，KDM5分为KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D共4个 亚 型，其 中KDM5C、KDM5D与肿瘤关联的研究报道较少。去甲基化酶KDM5A与KDM5B在病人肺癌组织中高表达，并远高于癌旁组织和正常组织，与肺癌的侵袭与转移密切相关，siRNA诱导的KDM5B表达量降低可抑制肿瘤细胞生长、侵袭与转移[12-13]。Settleman课题组在Cell[14]和Nature Chemical Biology[15]上发文指出KDM5A在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变的非小细胞肺癌耐药细胞中高表达，且与肺癌耐药形成相关，KDM5A敲除或小分子抑制剂CPI-455处理可增加细胞内H3K4Me3水平，有效清除肺癌耐药细胞。Cell和Science Translational Medicine分别发表题为《Drugging drug resistance》[16]和《Targeting the cancer cells that just won’t go away》[17]的评论性论文，强调KDM5在肺癌耐药性产生以及靶向KDM5清除耐药细胞方面的重要性。大量的研究表明：KDM5具有重要且广泛的肿瘤生物学功能（见图3），在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌等多种肿瘤组织中亦过表达，对增殖、周期调控、转移与侵袭、分化等过程发挥关键作用，且其表达水平与肿瘤的恶化程度相关[18-19]，KDM5表达水平降低或敲除可明显抑制肿瘤的转移与侵袭等[20]。Roesch等[21]报道抑制黑色素瘤细胞的氧化呼吸链可阻止KDM5B高表达的耐药细胞产生，增加对化疗药物的敏感性，进而克服黑色素瘤内源性多重耐药。基于KDM5重要的肿瘤生物学功能，其已成为一个重要的表观遗传调控靶点，设计靶向KDM5的小分子化合物是肿瘤靶向药物研发领域的一个重要方向。

2 去甲基化酶KDM5的结构

JMJD家族蛋白KDM5A与KDM5B结构从原核生物到高等生物高度保守[22]，分别含有1690个和1544个氨基酸残基，均包含JmjC、JmjN、ARID、PHD和C5HC2-ZF 5个结构域（见图4c），JmjN结构域与转录调节相关，在JmjN和JmjC中间有ARID和PHD1结构域，ARID为DNA结合结构域，PHD1特异性识别H3K4Me，促进KDM5的去甲基化酶活性，该结构域的缺失可导致细胞内H3K4Me3水平增高[23]，干扰PHD1-H3K4Me0相互作用能够降低KDM5B的去甲基化酶活性[24]，且PHD1-H3K4相互作用与KDM5B高表达的三阴性乳腺癌的转移密切相关[25]，是重要的去甲基化酶活性变构调节位点[26]；C端的PLU，PHD2和PHD3也是酶活性必须结构域[27]，其中PHD2/3能够识别H3K4Me2和H3K4Me3，PHD结构域的突变或小分子抑制剂可干扰其识别H3K4Me3底物，进而抑制白血病转化[28-29]；中科院上海生命科学研究院杜嘉木研究员课题组报道C5H2锌指结构域专一性识别H3R2和H3Q5，进而提高H3K4Me3的底物专一性[30]；JmjC结构域是KDM5家族酶催化活性中心，特异性识别H3K4位点。目前已有KDM5A/B-小分子配体复合物的高分辨晶体结构报道（见图4a与4b）[15,30]，其为进一步基于结构的抑制剂设计提供了结构基础。

3 KDM5抑制剂的研究进展

近年来，通过对化合物库的高通量筛选并结合相应的药物设计手段，已发现多种不同结构骨架的KDM5抑制剂，其中部分抑制剂（CPI-455、EPT103182）已经进入临床前研究[15,31]，但目前仍没有药物上市，大部分抑制剂还处于早期研究阶段。本部分将根据化合物的结构类型对代表性的KDM5抑制剂进行总结。

3.1 邻苯二酚类抑制剂

2013年， Sayegh等[7]利用ALPHA技术通过高通量筛选技术发现了一类具有邻苯二酚结构的化合物具有KDM5B抑制活性，如咖啡酸（1，IC50=2.88 μmol · L-1）、秦皮乙素（2，IC50= 4.60 μmol · L-1），该类化合物通过与KDM5B的辅酶Fe2+的螯合作用形成配合物从而发挥抑制作用。该类型化合物通常稳定性较差，易被氧化为醌式结构，且具有典型的假阳性化合物（pan-assay interference compounds，PAINS）结构片段，如邻苯二酚等，通常会造成一定的假阳性结果。基于此类结构的进一步优化需要全面的酶水平和细胞水平的生物学功能验证。

3.2 α-酮戊二酸类抑制剂

α-KG是KDM5的辅因子，以α-KG作为苗头化合物开发α-KG类似物，如N-草酰甘氨酸[32]，其 对KDM4A、KDM4C、KDM4E的IC50分 别 为250、500及78 μmol · L-1，N-草酰甘氨酸能够与α-KG竞争性结合Fe2+，但由于细胞内源性的α-KG浓度较高，此类抑制剂通常表现出较弱的细胞水平活性[33]。牛津大学Schofield教授课题组对三羧酸循环中产生代谢物与KDM5B的相互作用进行了探究，研究结果显示其代谢物水平的升高会竞争性抑制α-KG，从而抑制KDM5B的作用，促进肿瘤的发生发展[34]。如图5所示，三羧酸循环中间体与KDM5B的结合区全部集中在α-KG结合口袋，因此结合方式与α-KG类似，羧酸一端的羰基与Lys517形成静电相互作用，同时与Tyr425的羟基形成氢键作用，另一端的酮酸基团在与金属离子螯合的同时，还可与Thr581，Ser507，Glu501上的官能团产生氢键作用。其中柠檬酸（citrate，3）、异柠檬酸（isocitrate，4）及α-KG（5）的还原产物2-羟基戊二酸（D/L-2-HG，6和7）对KDM5B抑制作用较弱；琥珀酸（succinate，8）中等程度的抑制KDM5B（IC50为62 μmol · L-1），酶动力实验显示化合物8竞争α-KG（Ki为27 μmol · L-1）；延 胡 索 酸（fumarate，9）和苹果酸（malate，10）对KDM5B表现出较弱的抑制活性（IC50均大于100 μmol · L-1）；丁酮二酸（oxaloacetate，11）与α-KG竞争性的抑制KDM5B（IC50为15 μmol · L-1，Ki为54 μmol · L-1）。基于此结果，推测可能与肿瘤细胞中的线粒体代谢物异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变有关，正常细胞中IDH催化异柠檬酸产生α-KG，参与三羧酸循环，但肿瘤细胞中发生突变的IDH则会催化生成2-羟基戊二酸（2-Hydroxyglutaric acid，2-HG），在一定程度上抑制α-KG的结合[35]。

3.3 吡啶二羧酸类似物抑制剂

2，4-吡啶二羧酸（2，4-pyridinedicarboxylic acid，2，4-PDCA，12）是首个被证实能够在酶水平和细胞水平抑制KDM5B的吡啶二羧酸类化合物（IC50=3.0 μmol · L-1）[36]，其作为苗头化合物被广泛用于设计新型KDM5抑制剂（见图6）。KDOAM-25（13）有效抑制KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D（IC50均小于100 nmol · L-1），并对其他α-KG/Fe2+依赖的加氧酶亚家族、激酶与受体表现出很好的选择性，抑制黑色素瘤细胞MM1S的H3K4Me3去甲基化过程与增殖[37]；KDM5-C49（14）有效抑制KDM5A和KDM5B（IC50分别为40和160 nmol · L-1），并具有较好的选择性，其与KDM5A的结合模式如图6所示（PDB ID：5A3T）[38]，异烟酸基团竞争占据了α-KG的结合位点（图6a为α-KG与KDM5A的结合模式，图6b为化合物14与KDM5A的结合模式），与α-KG类似，化合物14的末端羧基与K501、Y409等周围氨基酸存在着广泛的极性作用和疏水相互作用，形成广泛的氢键网络。其吡啶环的氮原子和2位氨基甲基上的氮原子均与金属离子发生配位作用，从而形成双齿配体（见图6c），同时二甲氨基末端的6个原子限制在同一个平面构象中，尤其是N11的乙基基团与三甲基化的赖氨酸其中一个甲基有非常好的重叠效应，并被V584、N585包围，呈开放的“三明治”构象（见图6d）。但比较两者结合模式，α-KG的结合模式引起了N493侧链构象的改变，使得N493与Q557通过氢键作用作为“桥梁”连接在一起（见图6a），而14没有像图6e中α-KG那样占据配位点4和5，而是转移到5和6（见图6c），N493与占据4位金属配位点的水分子形成氢键，第2个水分子被带到异烟酸末端羧基上，使得抑制剂、N493与Q557三者之间通过至少3个水分子连接起来。以上构象表明化合物14通过竞争性地占据甲基赖氨酸结合位点（见图6f），从而对KDM5表现有强效抑制作用[38]。其酯化产物KDM5-C70（15）可抑制黑色素瘤细胞增殖，增加细胞内H3K4Me3水平[27]。

此外，Stafford课题组在2，4-PDCA类似物的基础上，设计并合成了其衍生物N19-0881（16），其对KDM5A和KDM5B均表现出强有效的抑制活性（IC50分别为13和2 nmol · L-1）[38]，如图7所示，研究其晶体结构（PDB ID：5IWO）[38]可以发现该化合物换用碱性较弱的吡唑环来代替吡啶环，并且降低了由于化合物与金属螯合作用过强可能带来的毒性，需要特别指出的是，结构中的吡啶联吡唑上的2个氮原子与金属离子络合，是活性显著提高的关键因素（见图7a）；另外，苄基基团部分仍保持与结合口袋的疏水相互作用，其中苯环4位氯原子与Q75的侧链氨基距离为3.2×10-10m，诱导形成Q75侧链氨基与S479的羰基氧和主链酰胺氮原子之间的2个氢键作用（见图7b）。同时，该化合物的细胞水平实验结果表明在乳腺癌细胞系ZR-5-1中亦具有较好的KDM5抑制活性（EC50= 90 nmol· L-1），并使细胞内H3K4Me3水平提高了10倍[39]。

3.4 嘧啶酮类抑制剂

Vinogradova 等[15]通过高通量筛选发现嘧啶酮类化合物CPI-455（17）能够有效抑制KDM5A、KDM5B与KDM5C（IC50分别为10、3和14 nmol · L-1），并对其他JMJD亚家族表现出良好的选择性。CPI-455与KDM5A的共晶结构（PDB ID：5CEH）（见图8），可以发现CPI-455的氰基与金属离子形成络合，同时7位羰基氧与N575侧链形成氢键作用（见图8a），中央嘧啶酮芳香环与Y472、F480、W503发生π-π相互作用，6位的异丙基则刚好占据Y409、S478形成的结合口袋，几乎没有多余的空间可以容纳更大的基团（见图8b）；同时细胞实验表明CPI-455能够增加多种细胞如PC-9细胞内H3K4Me3水平，在体内外模型上有效抑制厄洛替尼诱导的非小细胞肺癌耐药细胞的产生与存活[15]，同时能够有效抑制对替莫唑胺产生耐药性的恶性胶质瘤细胞的增殖[40]，在化疗时考虑与CPI-455联合用药可能会有更好效果。为进一步改善CPI-455的细胞水平活性和口服生物利用度，该课题组通过进一步的结构优化得到化合物18，其能够有效抑制KDM5A和KDM5B（IC50分别为15和4.7 nmol · L-1），对其他JMJD亚家族表现出良好的选择性，且细胞活性有所改善（H3K4Me3 EC50= 0.34 μmol · L-1）[41-42]； C497被鉴定为仅在KDM5成员中存在的非催化残基，为进一步提高对JmjC亚家族选择性，Saleta等[43]基于KDM5非催化区域特有的半胱氨酸C497设计了KDM5共价抑制剂PZ-7（19），对KDM5A和KDM5B的IC50均为10 nmol · L-1。共晶结构显示（见图9），化合物19保持了氰基与金属离子的配位作用和羰基氧的氢键相互作用，尽管未观察到共价键的形成，但氯乙酰基基团与C497距离仅为5.8×10-10m，C497的巯基完全具备进攻氯乙酰基的α碳发生取代反应形成共价结合的能力。体外酶活数据表明相较于对KDM4A及KDM4B，化合物19对KDM5其他亚型表现出强有力的选择性（大于500倍），同时由于化合物19与KDM5的不可逆结合能够有效减少与α-KG的竞争力（1 μmol · L-1α-KG条件下，IC50= 7 nmol · L-1），但细胞通透性较差（计算脂水分配系数clogP=-0.74）,因此细胞水平活性并未有较大的改善（EC50= 2.5 μmol · L-1）。

3.5 联氮杂芳基类化合物

如图10所示，2016年，Bavetsias等[44]报道的嘧啶酮稠合的联氮杂芳基类化合物20选择性抑制KDM4B和KDM5B（IC50分别为17和14 nmol · L-1），Caco-2细胞肠转运实验也表明其具有较好的细胞通透性（表观渗透系数Papp= 6.34×10-6cm · s-1）；2019年， Bavetsias课 题组在该化合物的基础上进行结构优化，得到化合物21，其对KDM4B和KDM5B抑制活性仍有效保持的前提下，显著提高其细胞通透性（Papp =11.64×10-6cm · s-1），在水溶性、血浆蛋白结合率以及其他药代动力学参数方面也有比较好的表现[45]。化合物21与KDM5B的共晶结构（PDB ID：6H4T）[45]显示（见图10），吡啶环和与其相连的吡唑环上的2个氮原子与金属离子的络合作用是保持活性的关键作用，稠和的嘧啶酮羰基氧和内酰胺的氮原子分别与K206、Y132形成分子间氢键作用，和化合物20中的苯环相比，21中的螺环体系稍微靠近V313，距离由4×10-10m变为3.7×10-10m，更有利于疏水作用的形成。

此外，葛兰素史克公司开发的GSK-J1（22）及其前药GSK-J4（23）均对KDM5B表现出一定的抑制活性（IC50分别为0.17和9.7 μmol · L-1），不过进一步对JMJD家族其他蛋白评价后发现22对KDM6A与KDM6B的选择性更高（IC50分别为0.053和0.028 μmol · L-1），但由于该化合物带有极性官能团，难以透过细胞膜，因此在细胞水平方面表现不佳（IC50＞ 50 μmol · L-1）。随后研究团队开发了相应的酯23作为前药，细胞活性也随之提高（IC50= 3.1 μmol · L-1）[46]。共晶结构（PDB ID：5FPU）显示（见图11），22结合在KDM5B的α-KG位点，其中芳基杂环部分与金属离子形成双齿配体，在ARG98侧链的作用下通过“waterbridge”间接将金属离子与HIS587连接起来，末端的羧酸基团羰基氧分别与LYS517、ASN509形成氢键作用[47]。

3.6 其他类

除上述KDM5抑制剂外，亦有一些其他具有代表性结构特征的KDM5抑制剂报道。德克萨斯大学安德森癌症中心Cheng教授课题组基于KDM5非催化位点处的Cys481设计了首个共价抑制剂N71（24），通过引入迈克尔受体，使小分子能够与Cys481巯基发生不可逆结合，形成共价相互作用，从而实现对KDM5的抑制作用[48]（见图12）。对24进行评价后发现对KDM5的选择性大大提高（KDM4A的IC50= 5.35 μmol · L-1，KDM5A的IC50=0.32 μmol · L-1，KDM5B的 IC50= 0.22 μmol · L-1，KDM6A的IC50＞ 60 μmol · L-1），并对KDM5亚家族表现出酶浓度依赖性抑制模式，在细胞毒测试中尽管该化合物对乳腺癌细胞有一定的抑制作用，但细胞内H3K4Me3表达量并未有明显变化，24是否脱靶或者细胞内存在H3K4Me代偿机制仍有待确定；其共晶结构（PDB ID：6DQB）[48]（见图12）显示24与其他抑制剂占据KDM5的α-KG活性位点作用模式不同，它通过结构中的烯丙基酰胺与C481的巯基基团发生迈克尔加成反应形成共价键结合。另外，酰胺键的羰基与C481主链的酰胺氮原子产生氢键作用，二甲氨基基团的2个甲基各自与R76和S479的主链羰基氧存在较弱的氢键作用。

Classon教授课题组通过筛选Genentech/Roche小分子化合物库发现了广谱KDM5抑制剂KDM5AIN-1（25，KDM5A IC50= 45 nmol · L-1；KDM5B IC50= 56 nmol · L-1；KDM5C IC50= 55 nmol · L-1）[49]，对其他亚家族包括KDM1A、KDM2B、KDM3B、KDM4C、KDM6A、KDM7B均表现出良好的选择 性（其 中KDM4C的IC50= 4.1 μmol · L-1，而 其他亚型蛋白在10 μmol · L-1浓度下的抑制率均小于50%），同时能够增加PC9细胞内H3K4Me3水平（EC50= 960 nmol · L-1）。研究者报道了其晶体结构（PDB ID：5V9T）（见图13）[49]，结构中吡唑环上的异丙基基团竞争性占据α-KG与H3K4Me3的结合口袋，吡唑环的2个氮原子及相邻的羰基氧共同与金属离子发生络合作用，形成双齿配体，同时吡咯烷与环丙基之间的酰胺羰基氧与K501的氨基产生氢键作用。

葛兰素史克公司公开的GSK467（26）对KDM5的选择性抑制作用（KDM5A-D的IC50均小于0.1 μmol · L-1）远高于对KDM4C（IC50= 5.1 μmol · L-1）和KDM3A的抑制活性（IC50= 33.9 μmol · L-1），但在多发性骨髓瘤细胞（MM1S）中的作用效果并不理想（50 μmol · L-1浓度下，Western-blotting结果显示H3K4Me3表达量没有明显增加），对该肿瘤细胞株的抗增殖活性也比较弱（IC50＞ 50 μmol · L-1），推测可能与GSK467的细胞膜通透性有关[27]；在其共晶结构（PDB ID：5FUN）[27]中可见（见图14），化合物小分子结合在α-KG活性口袋，吡啶环上的氮原子与金属离子形成单齿配体，吡啶并嘧啶酮母核与周围的Trp486、Phe496、Tyr488发生疏水相互作用，并且嘧啶酮的羰基氧与Lys517产生极性相互作用。

澳门大学Chung-Hang Leung教授课题组报道了首个基于金属铑的高活性高选择性KDM5A抑制 剂KDM5A-Rh-1（27，IC50= 23.2 nmol · L-1），对KDM1A、KDM4B及KDM6B抑制活性较弱（3 μmol · L-1时 抑 制 率 分 别 为61.1%、10.2%、58.4%），并且能够激活p27的转录表达以及增加三阴性乳腺癌细胞中H3K4Me2/3的积累，从而诱导细胞凋亡，实现抑制肿瘤细胞恶性增殖的目的，如能够显著抑制MDA-MB-231肿瘤细胞生长，IC50达到90.1 nmol · L-1，实现了很好的抗增殖作用。体内动物实验结果显示，化合物27显著抑制三阴性乳腺癌小鼠模型的肿瘤生长，每天口服给药4 mg/kg肿瘤抑制率达到48%，而对正常小鼠无明显毒副作用。

4 结语与展望

组蛋白去甲基化酶KDM5通过调控组蛋白赖氨酸去甲基化过程及参与形成靶基因启动子抑制性复合物，影响细胞增殖与凋亡，进而促进肿瘤的发生发展。因此，KDM5是新型抗肿瘤药物研发中的潜在药物靶标。已报道的KDM5小分子抑制剂复合物共晶结构也为进一步的药物设计提供了结构基础，有利于高活性高选择的KDM5小分子抑制剂的设计。迄今为止，已有较多结构类型的KDM5抑制剂报道，但因其本身的一些性质原因，如选择性差、作用机制不明确、与细胞内高浓度的α-KG竞争性结合等，目前尚未进入临床试验阶段，这也提示我们关于KDM5抑制剂的开发与作用机制的研究仍需进一步努力。