口蹄疫液相阻断酶联免疫吸附试验的注意事项

2020-12-16秦百众

中国畜禽种业 2020年4期

秦百众

（河南省平舆县农业农村局 463400）

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的可导致猪、牛、羊等动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，为一类动物疫病，且为人畜共患病，也是我国强制免疫的病种之一，其危害巨大，目前主要通过疫苗免疫接种对其进行预防控制。但对疫苗免疫抗体的检测不仅可以评估接种疫苗的免疫效果，也可以为养殖场制订更加合适的疫苗免疫方案提供一定的指导意见。液相阻断ELISA现主要用于猪、牛、羊血清口蹄疫A型、O型抗体的检测，是目前我国认可的一种标准诊断技术，其具有高灵敏性、特异性的特点，但液相阻断ELISA实验过程较复杂，操作步骤较烦琐，稍有不慎会造成实验失败。笔者总结分析了近几年实验室实际操作时出现的问题，总结了液相阻断ELISA实验的注意事项，以期为实验室检测人员提供借鉴。

1 试剂配制

1.1 样品稀释液的配制

使用浓缩磷酸盐-吐温缓冲液（PBST）液配制1倍PBST之前，要先确保浓缩液混合均匀，冬季天气寒冷，温度较低时，易有结晶，使用前需用恒温培养箱或水浴锅待结晶融化后使用，配制好的1倍PBST可于4℃冰箱储存1周。

1.2 抗原的配制

根据实际操作经验，不同批次的试剂盒所使用的病毒抗原工作浓度略有不同，故每次实验前需先确定好病毒抗原的工作浓度。若病毒抗原的工作浓度为1：10，其配制方法为1ml病毒抗原加入9ml配制好的1PBST。病毒抗原的配制宜现用现配。

2 样品的稀释

根据工作需要可选择10份、20份或40份样品布局，样品布局不同，血清样品的稀释方法不同。倍比稀释时要注意尽量不要有气泡，将10道排枪插入样品孔底，留一定空隙，使枪头始终保持在液面以下，缓慢吹吸6～8次即可。

稀释板的第11列为阳性对照的稀释，其成败关系到实验的判定，即实验是否成功的关键处之一。阴阳对照的稀释最好单独进行，使用单枪，倍比稀释规则同上。

3 加病毒抗原

稀释板的前11列整体加入配制好的病毒抗原50uL，第12列的阴性对照两孔亦加入50uL病毒抗原，第12列的3、4孔为空白对照孔什么都不加，第12列的最后4孔为病毒抗原对照孔，加入100uL病毒抗原。此步骤在样品量大时需注意，确保每块稀释板都加病毒抗原，加完后仔细观察每板液体量是否一致。

4 转板

样品不是整块板时，比如做20份布局样品，但某块板上只有10份样品，容易出现漏转情况。故此步骤需注意，无论稀释板上是否整板样品，均要整板转板。

5 洗板

洗板前确保洗板机洗液孔通畅、无堵塞；洗板时要仔细观察，确保无漏孔、溢孔现象。

6 加样

在样品量较大，所用包被板较多时，无论转板、洗板、还是加样都应按照某一特定顺序确保每块板反应时间均足够。加样时注意悬空垂直加样。

7 显色

液相阻断ELISA实验的显色底物分为A和B两种，可混合使用，但需注意要现用现配，且配制好的底物混合物在使用前要避光。且底物显色时间要根据室温的不同进行相应调整，如室温较高（比如炎热的夏季）时，底物反应时间应相应缩短；而室温较低（比如寒冷的冬季）时，底物反应时间可略微延长。

8 酶标仪读值

样品量较大时要仔细确认实验板数与最后读值板数量是否一致，避免漏读。

9 结果判定

9.1 结果有效性的判定

（1）病毒抗原对照孔的平均OD450nm应大于1.0；（2）阳性对照抗体效价在1：1024±1以内，临界值为阻断50%反应孔的对照OD450nm值，为病毒对照4孔中去掉最高值、最低值，剩余2孔的对照D450nm值除以4，即临界值应处于第11列的E孔与G孔值之间；（3）阴性对照血清的抗体效价＜1：8，即隐形对照2孔（第12列的前2孔）的数值均应大于临界值。