益生菌发酵果蔬制品研究进展

王亚琴，高振鹏，2，3*

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室，陕西杨凌 712100；3.陕西省农产品加工工程技术研究中心，陕西杨凌 712100）

益生菌是指人食用后对身体产生有益作用的活菌，通过改善和调节肠道微生物平衡来促进人体的健康[1]。益生菌在发酵乳制品方面应用广泛，但由于部分人群有乳糖不耐症，这极大地限制了乳制品的消费。研究发现果蔬汁/浆也是益生菌良好的发酵载体，由于果蔬中含有丰富的营养成分，如维生素、多酚和多糖等，不仅为益生菌在果蔬汁/浆中的存活和生长提供了丰富的基质，而且通过益生菌发酵使营养物质发生转化，丰富了产品的口感，增加了产品的营养功能特性[2-3]。益生菌发酵果蔬制品能改善人体肠道菌群，进而改善便秘、乳糖不耐症，抑制一些腐败菌在肠道内定植等。此外，我国是果蔬生产大国，但果蔬深加工率一直比较低，将益生菌引入果蔬深加工产业，不仅能提高我国果蔬深加工的比例，而且还能极大地改善国民饮食健康状况[4]。

目前市面上已有发酵果蔬制品，且中华人民共和国轻工业行业标准QB/T5356—2018 果蔬发酵汁已于2019年7 月1 日实施，行业标准规定果蔬发酵制品中活菌数要达到1×105CFU/mL 以上[5]。虽然相关的标准已经颁布，但是目前在市场上销售的活菌型果蔬制品相对较少，由于含有活菌的益生菌发酵果蔬制品在货架期会出现活菌数下降、后酸化等问题[6]，还需要进一步完善。此外，益生菌发酵果蔬制品的生物转化机制与其在人体内及果蔬汁中生物转化后的代谢产物对人体的互作机制还不清楚。本文就益生菌发酵果蔬制品的研究进行了综述，以期能在益生菌发酵果蔬制品进行市场化应用推广方面起到一定的指导作用。

1 益生菌发酵果蔬制品的研究现状

1.1 菌种筛选

益生菌菌种的筛选对果蔬发酵制品品质起决定性作用，既要满足其能在果蔬制品中生长，使发酵得到的产品感官品质好，又要满足活菌浓度在产品货架期达到国家行业标准的要求；此外，还需要适应人体肠道的高酸、高胆盐环境，能在肠道中定植、改善肠道菌群结构。益生菌筛选时还需考虑单一菌种与混合菌种发酵果蔬制品的差异，既要考虑产品口感，也要考虑菌种之间是否有拮抗作用。因此，益生菌菌种的筛选在果蔬制品发酵过程中起关键性作用。

Lu 等[7]分别利用瑞士乳杆菌L10、副干酪乳杆菌L26及鼠李糖乳杆菌HN001 发酵杨桃汁，发酵过程中在无菌条件下连续取样进行理化和微生物指标分析，筛选得出瑞士乳杆菌是较好的杨桃汁发酵菌种。孟掉琴等[8]通过益生菌耐酸、耐胆盐、产酸能力及复合菌株之间的拮抗作用筛选出最适的菌种组合，即嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌进行混菌发酵苹果浊汁，所得果汁的色泽、组织状态和口感都比较好。何嘉敏等[9]通过拮抗作用选出了嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌来发酵复合果蔬汁，以活菌数和SOD 值为指标选出了菌种的最佳配比。杭锋等[10]通过耐酸、耐胆盐性质筛选出能在人体胃肠道中存活的菌株，并进行单一菌株及混合菌株发酵复合果蔬汁比较，最终确定混菌发酵复合果蔬汁的品质高于单一菌种发酵。

综上所述，混菌发酵对某些产品的口感风味有一定的改善，但是大多数产品在货架期内确保一定的活菌浓度方面存在问题。益生菌发酵果蔬制品中益生菌的生长活力主要取决于所用菌种的种类、pH 值以及最终产品所含的乳酸浓度等[11]。益生菌发酵果蔬产品过程中常选用的菌种有植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌及干酪乳杆菌等。

1.2 产品稳定性

益生菌发酵果蔬制品既包含果蔬自身的营养物质，也包括发酵过程中转化产生的代谢产物以及益生菌菌体细胞。益生菌发酵果蔬制品加工方式不当时，会使产品在货架期会出现沉淀、褐变、变酸等现象，造成产品品质降低。果蔬汁中各种成分在发酵过程中也会发生相互作用，降低其稳定性。大部分果蔬汁在货架期间会发生颜色变化，主要原因是色素在果蔬汁贮藏过程中发生降解，影响果蔬产品中色素降解的物质是VC、还原糖、总酚等[12]。徐萌萌[13]通过测定胡萝卜饮料的粒径、黏度、电位及离心沉淀率等变化来表征益生菌发酵胡萝卜饮料稳定情况，研究发现贮藏温度和时间对益生菌发酵胡萝卜饮料稳定性的影响很小，各项指标的变化范围较小。通过测定胡萝卜饮料中性多糖、蛋白质和糖醛酸的变化，证实这些因素对胡萝卜饮料贮藏稳定性的影响，研究发现低温贮藏会延缓色素降解以及VC、还原糖、总酚的作用，从而维持色素的稳定。果蔬汁中多酚的抗氧化、蛋白质的溶解性及糖基化都会受到蛋白质、多糖与多酚两两相互作用的影响，此外，三者间的相互作用在果蔬汁中也能引起体系不稳定，使果蔬汁浑浊或沉淀[10]。

益生菌发酵果蔬制品最重要的标志之一就是活菌浓度，益生菌在货架期会出现活菌浓度下降，导致活菌浓度达不到国家标准最低要求，围绕此问题，科研工作者开展了大量研究。如丘裕[14]测定了4 ℃下贮藏28 d 的干酪乳杆菌和植物乳杆菌发酵的南瓜汁、火龙果汁以及混合汁的pH、可滴定酸度和活菌数，研究结果表明，南瓜汁及火龙果汁中的植物乳杆菌和干酪乳杆菌的活菌数维持在2.2×109～1.8×109，新陈代谢缓慢，且pH 和酸度变化不大，能够保证益生菌活菌数量在货架期内达到标准要求，总体来说，低温对益生菌发酵的贮藏起到积极作用。ZHU等[15]研究了旧金山乳杆菌发酵苹果汁、橙汁和番茄汁贮藏期间pH 和活菌数的变化，结果显示三种果汁的pH 都呈下降趋势，主要原因是旧金山乳杆菌在果汁中产生了一定量的乳酸，pH 较低的环境更适于益生菌的生长，三种果汁中的活菌数虽然有所下降，但均达到了国家标准规定的水平。

水果、蔬菜品种繁多，每种果蔬所含成分以及含量都有很大的差异，近年来学者们研究了许多关于控制益生菌发酵果蔬汁的稳定性技术，例如酶解、均质、热烫等[9]。酶解及均质在工业生产中由于成本等问题没有普遍应用，而热烫相对来说成本低，在工业中普遍被应用，但是对产品品质的伤害比较大，且作用机理尚不明确，需要进一步研究。此外，益生菌在产品货架期稳定性也随果蔬品种的变化发生改变。

1.3 营养成分变化

益生菌发酵果蔬汁不仅能发挥益生菌的功效，也能使果蔬汁中的营养成分发生变化。果蔬产品本身就是低脂肪、低蛋白、糖类化合物和维生素含量丰富，其中维生素是人体维生素的主要来源，经过益生菌的发酵，一些营养成分发生变化，转化成机体更容易吸收的营养成分。例如益生菌可以将蛋白质转化为小分子多肽、大分子多糖转化为低聚多糖。徐萌萌[13]通过对益生菌发酵胡萝卜汁的营养成分测定分析，结果显示发酵胡萝卜汁中含有丰富的矿物质、维生素，其中谷氨酸含量最高，具有低脂肪、低蛋白的特点。胡萝卜汁经发酵后蛋白质含量降低，脂肪含量基本保持不变，蛋白质降低的原因是发酵过程中蛋白质为菌体生长提供了能量。王万升[16]将益生菌发酵胡萝卜原浆和益生菌发酵雪梨原浆中的营养成分进行比较，发现有机酸、B 族维生素、粗蛋白以及氨基酸含量有所变化，经益生菌发酵之后胡萝卜和雪梨浆中的乳酸含量增加了十倍左右，且酸性环境中益生菌更易于在肠道中定植。粗蛋白、氨基酸和B 族维生素在发酵前的杀菌过程中损失严重，基本检测不出来，但经益生菌发酵后，它们的含量都增加。高振鹏等[17]采用混合益生菌发酵复合苹果汁，得出发酵使复合苹果汁中总糖含量下降，可滴定酸含量上升。也有研究发现，用植物乳杆菌S-811发酵仙人掌梨汁能对其中所含的维生素产生保护作用，这种保护作用可能与pH 值的下降有关[18]，因为维生素在酸性环境中更稳定。

可见，益生菌发酵果蔬制品能够使果蔬营养成分发生生物转化或生物降解，产生更易于机体吸收的营养成分，增加了益生菌对肠道的改善功能，使发酵果蔬制品的营养更加丰富。

1.4 动力学及货架期预测

果蔬种类繁多，成分复杂，益生菌在不同品种果蔬汁中的生长情况不尽相同，即使相同的益生菌发酵不同品种果蔬时，发酵动力学变化也比较大，因此，建立适合不同果蔬特性的益生菌发酵动力学，对于指导发酵过程意义重大。发酵动力学主要研究各种环境因素与微生物代谢随时间变化的相互作用规律。益生菌发酵果蔬动力学主要通过分析菌种生长、产物合成和底物消耗来研究发酵果蔬动态变化，掌握发酵动态变化规律，进而更好地控制发酵条件，生产出更好的产品。高振鹏等[17]研究了益生菌发酵苹果汁的动力学模型，建立了益生菌发酵苹果汁和产生总酚的动力学模型，结果显示，理论值和实验值的平均误差很小，说明模型很好地描述了益生菌发酵苹果汁中总酚的变化。杨春敏[19]研究了苹果渣多菌群发酵菌体生长模型、产物生成模型和基质消耗模型，建立的多菌群益生菌发酵动力学模型能够准确预测发酵过程。

此外，由于益生菌发酵果蔬汁中含有活益生菌，果蔬汁中的活菌浓度、感官指标、酸度及代谢产物等指标是动态变化的，建立适合益生菌发酵果蔬汁的货架期预测模型对于果蔬汁的销售至关重要。李海萍[20]应用Arrhenius关系式建立的货架期预测模型能够准确预测益生菌发酵蜜柚饮料的货架期，通过测定维生素C、微生物指标及感官评价变化，得出清汁型和浑浊型益生菌发酵蜜柚饮料的货架期分别为22 和24 个月。影响发酵产品货架期的主要因素是微生物，益生菌发酵果蔬制品中活菌数在贮藏及其销售期间是否符合行业标准直接影响产品的货架期。另外贮存温度、酸度、包装方式及材料也会影响果蔬产品的货架期。Pimentel 等[21]报道了添加益生元低聚果糖和副干酪乳杆菌的澄清苹果汁生产益生菌饮料，产品可接受性与纯果汁相似，在冷藏条件下，益生菌饮料保质期可达28 d。采用玻璃瓶作为新饮料的包装材料，能够保持副干酪乳杆菌的活力。有研究发现新鲜火龙果汁中加入乳酸菌发酵火龙果汁，货架期比鲜榨的火龙果汁延长了3 个月，而颜色和口感都未发生改变[22]，乳酸菌发酵降低了用于生产有机酸和次级代谢物的游离糖的含量，限制了果汁中腐败微生物的生长[23]。

由于益生菌在不同种类果蔬制品中代谢活动不同，研究动力学过程中所选择的模型也不相同，只有选择合适的模型才能更好地描述发酵过程变化。益生菌发酵果蔬制品中含有活菌，其货架期较短，并且在货架期也一直在发生变化，从而影响果蔬制品的质量。保证益生菌发酵果蔬制品的品质及延长货架期是科研人员一直不懈努力的方向。

1.5 香气成分变化

果蔬中含有大量的风味物质，经过益生菌发酵后也会产生新的发酵风味。菌种种类、发酵时间、温度、底物种类及浓度等都会影响益生菌发酵果蔬中风味物质的产生，这些风味物质主要有酸、醇、醛、酮、萜类等。由于益生菌种类、果蔬种类不同，经过发酵后会产生不同特征的香气物质。这些变化如何发生、产生的机制如何，一直是研究者要探索的问题。

有学者采用GC-MS 测定了副干酪乳杆菌发酵功能性石榴饮料中的挥发性成分，结果显示，贮藏时间、底物及发酵对香气均有显著的影响，特别是乙醇、2-癸酮和乙酸甲酯显著增加，而己醇、2-乙基-1-己醇和壬醛等化合物减少，果汁中的酯类含量也有所增加[6]。Lu 等[7]开展了瑞士乳杆菌L10、副干酪乳杆菌L26 和鼠李糖乳杆菌HN001 对发酵杨桃汁风味的影响研究，研究得出不同益生菌菌株产生的挥发物变化较大，瑞士乳杆菌发酵杨桃汁对醛类及除苯甲酸甲酯外的所有内源酯降解效果显著，能产生具有水果味和霉味的2-壬酮。瑞士乳杆菌和副干酪乳杆菌混菌发酵杨桃汁都会产生较多具有坚果味和杏仁香气的醛类物质，而副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌则产生具有柑橘和花香味的芳樟醇。朱珺[24]等用一株植物乳杆菌发酵果蔬汁，结果显示高酸性果汁如芒果汁和芦荟汁在发酵后增加了酸爽风味，表明植物乳杆菌具有很强的耐酸性，而胡萝卜汁、生姜汁、大蒜汁带有生冲味，在发酵之后生冲味明显减少且口感更加清新、醇香可口。

益生菌发酵果蔬制品中香气成分产生机制复杂，不同菌种发酵果蔬制品产生的风味物质也不同。由于菌种发酵代谢产物的研究还不够成熟，目前主要通过分析果蔬成分变化以及菌种代谢物质来确定发酵所产生的风味物质，因此，益生菌发酵果蔬制品中风味物质的研究还有一定的局限性。

1.6 制品功能评价

果蔬含有大量的营养物质。如何进一步提高果蔬中的这些功能物质含量是研究者亟待解决的问题之一。益生菌能将果蔬中的营养物质进行生物转化，产生一些功效成分。科学证明人类食用了含有活菌的益生菌发酵果蔬制品后，能够对人体产生功效，如抗氧化活性、防腐、降血糖、改善肠道菌群等。Li 等[25]利用植物乳杆菌发酵胡萝卜汁，结果显示发酵胡萝卜汁中产生短链脂肪酸，能促进乳酸和双歧杆菌的生长，从而降低血糖。另外，植物乳杆菌的代谢产物和胡萝卜汁中的生物活性物质都具有调节血糖和胰岛素、胰高血糖素、降血脂、减少氧化应激的功能。研究人员用植物乳杆菌发酵仙人掌梨汁喂养小鼠的研究表明，植物乳杆菌发酵仙人掌梨汁能够使受检病例的体重显著下降，肥胖小鼠的脂肪指数降低[18]。Mazlan 等[26]研究发酵苦瓜汁得到α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，这与苷元和其他酚类化合物的含量和有效性较高有关。朱珺等[24]研究了一株具有益生特性的植物乳杆菌发酵果蔬汁，该果蔬汁能够促进肠胃的蠕动，具有通便功能。

目前功能性食品越来越受到人们的欢迎。开展增加果蔬制品功能性研究，指导人们合理膳食是未来发展的方向。益生菌发酵果蔬制品功能评价是科研工作者研究的方向，既要分析鉴定发酵产生了哪些新的成分，还要叠加益生菌改善肠道菌群的功能，因此，功能评价的周期较长，只有经过严格评价后才能确定其功效。

1.7 产品中功能成分转化

益生菌发酵果蔬制品中一些功能成分会发生转化，特别是一些酚类物质之间的转化[27]。果蔬中含有大量的酚类物质，具有抗氧化活性。酚类化合物大多数能够到达结肠，在肠道微生物的作用下，酚类化合物会被转化，产生代谢物，这些代谢物会被机体吸收，从而产生生理效应。由于机体肠道微生物的差异性，所产生的代谢物有所不同，产生的生理效应也会有差异[28-32]。

有研究发现，植物乳杆菌发酵芸豆提取物，发酵后提取物中羟基肉桂酸的含量增加[33]，羟基肉桂酸是蔬菜中常见的多酚化合物之一，具有广泛的生物活性，以糖基的形式广泛存在于寡糖或多糖上，一些微生物产生的多糖水解酶能将与多糖或寡糖结合的肉桂酸从植物多糖中释放出来，导致其含量增加[34]。Emmanuel 等[35]研究了乳酸菌发酵桑葚汁中酚类成分的变化情况，结果发现乳酸菌发酵可以使桑葚汁中的总酚、花青素、总黄酮含量均增加。总酚增加的原因是发酵使桑葚汁中更多的糖基化酚脱去糖基转为为酚类化合物，黄酮醇增加的原因可能是复杂的多酚被乳酸水解酶分解成简单的黄酮醇。Mantzourani等[36]研究了植物乳杆菌ATCC 14917 菌株生产功能性石榴汁，得出发酵石榴汁中的植物乳杆菌ATCC 14917 在储存期间的高活性与发酵生成的酚类化合物有关。也有研究发现酚类化合物可以作为益生元[37]。

根据文献资料，益生菌发酵果蔬制品中酚类化合物含量增加的主要原因是在益生菌作用下能够使结合态多酚转化成游离态酚类化合物，不同菌株产生的水解酶种类不同，转化产生的酚类化合物也有所区别。

2 益生菌发酵果蔬汁存在的问题

2.1 活菌数难保持

由于益生菌发酵果蔬制品中含有活菌，产品品质在货架期内一直在动态变化，保持益生菌发酵果蔬制品高活菌浓度是科研工作者努力的方向。目前，市面上出售的益生菌发酵果蔬汁活菌型产品的保质期较短，在货架期由于贮藏温度、时间、pH 以及菌种本身性质影响活菌，使其逐渐失活，活菌临界浓度在食用时约为106～107CFU/mL[38]。此外，由于果蔬种类繁多，一些高酸果蔬产品无法提供最佳生长环境来确保益生菌活性，导致益生菌在发酵过程中失活。虽然益生菌发酵奶制品活菌数保持方面的研究较多，但是发酵果蔬汁中活菌数保持方面的研究几乎是空白。目前通过一系列措施如细胞包埋或固定、添加益生元物质和微胶囊等能保持益生菌活性，但是这些技术大多有一定局限性，大面积推广使用还需要进一步研究[39-41]。

2.2 风味问题

益生菌发酵果蔬汁过程中部分菌种会产生果香味，也会产生让人不愉快的特殊风味[42]，且这些风味的生成比较复杂，许多风味至今没有鉴定清楚。在益生菌发酵果蔬汁中，挥发性风味物质种类增加，其中醇、酯类物质增加明显，有利于酯香型果汁果香和花香的突出（如苹果汁和梨汁）；果蔬汁中氨基酸变化显示出其与挥发性风味物质存在相互转换的关联性[43]。益生菌在食品饮料的感官、营养以及卫生品质中起着重要的作用，在发酵过程中会产生与菌种相关的芳香化合物来展现食品的风味[44]。益生菌发酵果蔬汁的特征风味物质不仅取决于风味物质的种类和含量，同时还与其风味特征、阈值相关，需通过嗅辨仪结合气相色谱-质谱以及气味活度值法综合分析特征风味物质[45]。风味的产生与果蔬的品种、菌种的选择都有一定的关系，要清楚风味的来源就应明确果蔬中的风味物质以及菌种在发酵过程中互相之间产生拮抗及其关联的关系。另外，益生菌异味的产生还与贮藏时间、底物及发酵的菌种有关，机理比较复杂。由于在分子生物学方面的相关研究还不够深入，这些问题一直没有得到解决。

2.3 稳定性问题

复合果蔬汁在储藏过程中会产生沉淀，影响果蔬汁的货架期，从而降低商品价值，成为制约果蔬汁工业发展和提高果蔬汁品质的关键问题。关于果蔬汁后混浊原因的研究已有70 多年的历史，早在20 世纪40 年代就有学者定性研究了苹果汁混浊物，发现沉淀物中含有氮、硫、磷、铁等元素[46]。在果蔬汁被益生菌发酵后，由于菌种与果汁的相互作用，沉淀产生的机制更加复杂。一些黏度较大的益生菌发酵果蔬浆在储存的过程中黏度会逐渐增大，对果蔬浆品质影响很大[47]。目前，果蔬汁稳定性问题已经取得一定突破，发现在果蔬汁中主要悬浮固体为多糖和微生物。近几年膜过滤技术被广泛应用，但是成本相对较高，且还不成熟，仅能除去沉淀物质而将益生菌保留在果蔬汁中的技术未突破，还需要进一步努力。总之，果蔬汁稳定性方面仍有一些问题有待解决。

3 益生菌发酵果蔬制品未来的发展趋势

益生菌发酵果蔬制品不仅保留了果蔬的营养物质，而且在发酵过程中发生生物转化产生了代谢产物，赋予了产品特殊的发酵风味。益生菌发酵果蔬制品中的活菌能够通过改善人体肠道环境来改善人体健康状况，果蔬汁能为人体提供营养物质。虽然我国的益生菌发酵果蔬汁产业还处于起步阶段，但是发酵果蔬汁的市场发展前景十分广阔。结合益生菌发酵果蔬制品的发展方向以及现代科学技术发展，益生菌发酵果蔬制品未来的发展方向主要体现在以下方面：（1）性能稳定、高活性、后酸化可控的专用直投式果蔬益生菌菌剂的制备及开发；（2）功能性益生菌的筛选以及功能性益生菌发酵果蔬制品的开发，如降脂、降糖、降压、抗衰老、抗氧化等益生菌发酵果蔬制品的研制；（3）针对益生菌发酵果蔬制品中果汁褐变、活菌存活时间短、产品稳定性较差等问题展开的活菌浓度保持技术、稳定性及防褐变技术研究；（4）益生菌发酵果蔬制品会产生复杂的香气物质，研究发酵过程中果蔬营养物质及菌种互相作用关系，明晰香气物质产生的机制；（5）益生菌发酵果蔬制品过程中，进一步明晰多酚、蛋白质、多糖等营养成分经过生物转化后的代谢产物种类、益生菌产生的酶种类以及转化机理研究；（6）高产功能性代谢产物的益生菌的筛选及新型发酵果蔬制品的开发，例如高γ-氨基丁酸的益生菌发酵果汁、高辅酶Q10的益生菌发酵果汁等。