养殖塘底泥中溶藻细菌的分离及16S rRNA序列分析

黄晶晶，陈 敏

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311121)

近年来，有害藻类水华的爆发日趋频繁，不仅使水环境遭受严重破坏，更直接影响人们的饮用水源及公共卫生健康，同时也给水产资源和养殖业造成了极大的危害和损失[1].因此，积极探索藻类水华的发生规律以及经济有效的防治方法，无疑具有非常重要的科学意义和应用前景[2].

目前，灾害性水华治理措施主要包括营养限制、直接除藻和生物治理技术.其中营养限制是治理的主要目标，但往往要经过若干年才能取得成效，因此对于水华爆发的直接控制要求而言具有局限性.直接除藻包括化学药品杀藻和机械捞藻等措施，一般能在短时间内发挥作用，但在人力和物力方面耗资巨大，并且不可避免地对水环境产生不利影响，也不能从根本上解决富营养化问题.而生物治理技术被认为是能短时控藻同时又作用显著的生态治藻策略[2-3].生物控藻主要是利用具有除藻作用的植物、动物或微生物来控制藻类生长的一类方法，其中以溶藻细菌的除藻研究最为深入[4-5].本研究从杭州某养殖塘底泥中直接分离细菌，从中筛选溶藻活力强的菌株，以期为富营养化水环境的藻类治理提供理论基础和应用参考.

1 材料与方法

1.1 藻种

铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)，购于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心.

1.2 样品

从杭州某水产养殖池塘挖取底泥，装于无菌塑料离心管中，4 ℃暂时保存.带回实验室后立即用于菌种分离.

1.3 培养基

BG-11培养基：NaNO31.5 g·L-1，K2HPO40.04 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.075 g·L-1，CaCl2·7H2O 0.036 g·L-1，Na2CO30.02 g·L-1，柠檬酸0.006 g·L-1，柠檬酸铁0.006 g·L-1，氨苄青霉素50 g·L-1，琼脂20 g·L-1，pH 7.1.

LB培养基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，琼脂粉15 g·L-1， pH 7.0～7.2.

1.4 藻种培养

按10%的接种量将藻种接入装有BG-11培养基的三角瓶中，用无菌透气膜封口，放入25 ℃恒温光照培养箱培养，光照强度3 000 lx，光暗周期比14 h∶10 h，每天摇晃4次.培养14 d左右，至叶绿素a的质量浓度达到0.7 mg·L-1[6].

1.5 溶藻细菌的分离

称取10 g底泥样品，加入100 mL无菌水充分振荡，静止后取上清液，按10%的比例接入铜绿微囊藻培养液(叶绿素a质量浓度为0.7 mg·L-1)中，25 ℃光照强度3 000 lx，光暗周期比14 h∶10 h，培养7 d.每天定时摇晃三角瓶4次，并观察有无黄化现象.以藻液中加入等量蒸馏水为对照组.

取有明显黄化现象的培养液，经适当稀释后涂布LB培养基平板，放入37 ℃的恒温箱中培养24～48 h，用接种环挑选不同的单菌落进行划线分离纯化，4 ℃冰箱保存[7].

1.6 溶藻活性测定

将上述分离的菌株分别接入到LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养至每毫升含菌108个.将铜绿微囊藻藻种活化后接种于BG-11培养基，置于25 ℃恒温光照培养箱中静置培养，光照强度3 000 lx，光暗周期比14 h∶10 h，至藻液叶绿素a质量浓度为0.7 mg·L-1.分别取5 mL菌液和50 mL藻液均匀混合，放入37 ℃、180 r/min的摇床中振荡培养，48 h后取样测定叶绿素a质量浓度[7].

1.7 叶绿素a质量浓度及去除率的计算

用叶绿素a质量浓度表征溶藻效果.采用丙酮提取分光光度法测定叶绿素a质量浓度：将藻液摇匀后，取30 mL加入到离心管中，4 000 r/min离心10 min，吸去上清液，再加入10 mL 90%丙酮溶液，黑暗中提取24 h，4 000 r/min离心10 min，取上清，用722型分光光度计测定OD664[8].叶绿素a的去除率按下式计算：

R=(C0-Ce)/C0×100.

式中，R为叶绿素a的去除率(%)；C0为对照组藻叶绿素a的质量浓度(mg·L-1)；Ce为处理组藻叶绿素a的质量浓度(mg·L-1).

1.8 细菌16S rRNA基因测序

16S rRNA基因扩增参见文献[9].PCR产物送交上海英俊生物技术公司进行序列测定.

1.9 系统发育树的构建

将测序结果提交到GenBank中得到基因序列登录号，并利用EzTaxon server 2.1[10]查找与该菌株相似性较高的模式菌株的16S rRNA基因序列.采用MEGA5.0软件包中的Kimura 2-Parament model及Neiggbor-Joining法进行聚类分析并构建系统发育进化树.

2 结果与分析

2.1 溶藻细菌的分离和筛选

将底泥样品接入铜绿微囊藻藻液中，经7 d光照培养，出现了藻液的黄化现象，而加蒸馏水的对照组未观察到黄化现象.这表明加了底泥样品的藻液中藻细胞被破坏，可能存在溶藻细菌.取黄化液进行稀释并涂布平板，根据菌落的颜色、大小和形状，共分离到20株菌株.将纯化后的菌株进行溶藻活性测定，结果表明，20株菌株中共有14株显示出强弱不同的溶藻活性，其余的6株无溶藻活性(表1).有9株菌株(MS7、MT27、MH1、AT39、AT62、AT9、MT22、AS6、MH2)的叶绿素a去除率达到了50%以上，其中MS7和MT22的叶绿素a去除率分别达到了91.0%和 73.7%，溶藻活性较强.

表1 溶藻细菌的筛选Tab.1 The isolation of algicidal bacteria

2.2 16S rRNA基因测序和系统发育树构建

对有溶藻效果的14株菌株进行16S rRNA基因测序.测序结果提交到GenBank中得到基因序列登录号，并利用EzTaxon server 2.1查找与该菌株相似性较高的模式菌株的16S rRNA基因序列.比对结果如表2所示.

表2 溶藻细菌16S rRNA基因测序比对结果Tab.2 Results of the best march to known species of algicidal bacteria

结果表明，除了AT菌株以外，其他13株均归为芽孢杆菌属(Bacillus)，其中有2株菌株与苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的同源性分别为99.6%和99.7%；有4株菌株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的同源性在99.7%～99.9%；有1株菌株与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethy-lotrophicus)的同源性达到99.7%；另有3株菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的同源性达到99%以上；其他各有1株菌株分别与蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)和死亡谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)的同源性达到99.9%、99.8%和99.6%.AT菌株是唯一不属于芽孢杆菌的细菌，与墨西哥微小杆菌(Exiguobacteriummexicanum)的同源性达到了99.9%.

从 Genbank数据库中搜索与溶藻细菌相对应的模式菌株的16S rRNA 序列，进行系统发育树的构建，结果如图1所示.

图1 溶藻菌株的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of algicidal bacteria

3 讨论

溶藻细菌是指能够通过直接或间接方式抑制或杀死藻细胞，从而导致藻细胞溶解的一类细菌，对水华的控制和维持藻类的生物量平衡有非常重要的作用，已经引起越来越多的关注.溶藻细菌一般从水体直接分离，具有很好的生态安全性.本研究以养殖塘底泥为分离源，采用稀释涂布法从藻类黄化液中分离得到细菌20株，通过溶藻活性的初步研究，有 14株显示出强弱不同的溶藻活性，其中MS7和MT22的叶绿素a去除率分别达到了91.0%和 73.7%，是2株溶藻活性较强的菌株.

目前，已被分离和报道的溶藻细菌主要有芽孢杆菌属、交替单胞菌属(Alteromonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、哈赫拉菌(Hahellachejuensis)、放线菌(Actinobacteria)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和弧菌属(Vibrio)等[4].其中芽孢杆菌是国内外近年来研究较多的一类溶藻细菌，对水生生态系统的生物修复有很重要的意义[11]，已报道的具有溶藻作用的芽孢杆菌主要有蜡状芽孢杆菌[12]、解淀粉芽孢杆菌[13]、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)[14]和梭形芽孢杆菌(B.fusiformis)[15]等.本研究分离的14株溶藻细菌，经16S rRNA基因测序，除1株为微小杆菌属(Exiguobacteriu)外，其余13株皆为芽孢杆菌属，可见养殖池中本身存在大量的对于铜绿微囊藻有抑制作用的芽孢杆菌，这对于利用土著细菌重建水体良性的生态系统有重要的参考价值.同时，研究结果为新型生物杀藻剂的深入研究和开发利用奠定了基础.