基于网络药理学的生姜泻心汤治疗结直肠癌的作用机制研究Δ

陈 熹，杨 婷，章从恩，于小红，赵奎君，马致洁#

(1.首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科，北京100052； 2.山西医科大学药学院，山西 太原 030001)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球第三大常见的恶性肿瘤，每年估计有140万例新发确诊病例和超过69万例患者死亡[1]。在我国，CRC的发病率及死亡率一直居高不下。近十年来，化疗方案的不断完善显著地延长了CRC患者的生存期。5-氟尿嘧啶、铂制剂、羟基喜树碱、长春新碱、甲氨蝶呤、紫杉醇和西妥昔单抗等被广泛应用于CRC的治疗[2]。然而，肿瘤的多重耐药性问题及化疗药普遍的严重不良反应均对患者的治疗效果有较大影响，从而导致预后不良。

越来越多的证据表明，传统中药复方因其化学成分多样和多靶点、多途径的药理作用等特点，在治疗CRC方面表现出了巨大潜力。生姜泻心汤收录于《伤寒杂病论》，具有和胃消痞、散结除水的功效，目前较多用于CRC化疗相关毒性的防治，改善CRC患者的预后[3]。生姜泻心汤能够应用于消化系统恶性肿瘤及癌前病变，但其药效机制尚不明确。

网络药理学是基于系统生物学、蛋白组学及药理学等，应用高通量筛选、网络可视化等技术来揭示药物、靶点、通路和疾病直接复杂关系的一门学科。网络药理学与中医药体系整体观念、辨证论治的观点不谋而合。因此，与网络药理学结合，是研究发展中药复方，明确其物质基础和作用机制的强有力的手段。为此，本研究采用网络药理学方法，从生姜泻心汤的物质基础出发，立足于中医药理论整体思想，分析其治疗CRC的分子机制，同时为后续研究提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 生姜泻心汤药物化学成分及作用靶点筛选

采用中药系统药理学数据库和分析平台(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[4]检索生姜泻心汤方中各味中药。根据口服利用度(oral bioavailability，OB)≥50%且类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为阈值初步筛选出方中活性化合物及相关作用靶点，并对已发表文献进行检索，对数据库未收录的活性成分进行补充。

1.2 CRC相关靶点筛选

以“colorectal cancer”“colon cancer”和“colorectal carcinoma”为关键词，在OMIM数据库(http://www.omim.org)[5]、TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[6]和GeneCards数据库(https://www.genecards.org)[7]中进行数据挖掘。合并3个数据库中靶点，删除重复值后获得CRC疾病靶点。

1.3 生姜泻心汤-CRC靶点PPI网络构建

使用Venny工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，将生姜泻心汤相关靶点与CRC靶点取交集并绘制韦恩图。将交集靶点上传至STRING数据平台(https://string-db.org)[8]，隐藏网络中无联系的节点，得到PPI网络，使用Cytoscape 3.6.1软件对所得结果进行可视化处理，并使用内置工具分析连接度、中介中心度及接近中心度等网络拓扑参数，判断核心靶点发挥药效的主要活性成分。

1.4 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路富集分析

运用Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html)[9]，对生姜泻心汤和CRC共同作用得到的交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。以P<0.05为阈值，将其按P值升序进行排序，并选取排序居前20位靶点的生物学过程和代谢通路。使用R语言绘制气泡图进行可视化。

1.5 生姜泻心汤-CRC-通路网络的构建

根据GO功能富集分析结果，预测治疗CRC的主要靶点，并使用Cytoscape 3.6.1软件构建生姜泻心汤-CRC-通路网络图，根据网络拓扑学参数判断核心靶点发挥药效的主要活性成分。

2 结果

2.1 生姜泻心汤活性靶点

初步获取生姜化学成分4种，甘草化学成分38种，人参化学成分7种，干姜化学成分4种，黄芩化学成分6种，半夏化学成分13种，黄连化学成分4种，大枣化学成分4种。其中4种化合物为2种或以上中药所共有。生姜泻心汤中各成分作用靶点合并去重后共获得147个作用靶点，见图1。

2.2 CRC相关靶点

通过检索OMIM、TTD及GeneCards数据库，并结合已发表文献,合并删除重复值后，共获得CRC相关蛋白靶点1 883个。

2.3 生姜泻心汤-CRC靶点PPI网络的构建

通过韦恩图发现生姜泻心汤和CRC共同核心靶点62个，结果见图2。将关键靶点信息提交至STRING平台，经过Cytoscape 3.6.1可视化后得到生姜泻心汤PPI网络，结果见图3。经统计分析，所有关键靶点连接度平均值为23.32，中介中心度平均值为0.01，接近中心度平均值为0.62。其中，3项参数均高于平均值的关键靶点共13个，分别为AKT1、TP53、MAPK3、JUN、VEGFA、MAPK1、CASP3、ESR1、MMP9、PTGS2、FOS、MAPK14及AR，其可能为生姜泻心汤治疗CRC的潜在核心靶点。

2.4 关键靶点通路与功能的富集分析

应用Metascape数据库对生姜泻心汤治疗CRC的62个关键靶点进行富集分析，并使用R语言绘制气泡图进行可视化，结果见图4。气泡颜色由深至浅表示-lg(P)从大到小，该值越大代表显著性越强，气泡越大则代表富集在该通路的基因计数越大；横轴代表靶点富集在该通路的程度，数值越大代表富集程度越大。

GO分析结果提示，生姜泻心汤主要参与的生物学过程(biological processes，BP)包括细胞对脂质和有机环状化合物的应答、类固醇激素和毒性物质的应答、生殖系统和构造的发展变化等。相关靶点主要影响的分子功能(molecular functions，MF)富集于转录因子结合、核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、蛋白激酶结合及RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合等。药物作用靶点涉及的细胞成分(cellular components, CC)主要富集在细胞质囊泡腔、转录因子复合体、核转录因子复合体、分泌颗粒腔及RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物等。生姜泻心汤治疗CRC参与的通路主要有恶性肿瘤相关通路、CRC相关通路、白细胞介素17信号通路、内分泌耐药通路及细胞凋亡通路等。

图1 药物-成分-疾病靶点网络图Fig 1 Network diagram of drug-ingredients-disease targets

图2 生姜泻心汤-结直肠癌靶点韦恩图Fig 2 Venn diagram of Shengjiang Xiexin decoction-CRC target gene

图3 生姜泻心汤-CRC-核心靶点PPI网络图Fig 3 PPI network diagram of Shengjiang Xiexin decoction-CRC-core targets

2.5 生姜泻心汤-靶点-通路网络图的构建

应用Cytoscape 3.6.1构建生姜泻心汤-CRC靶点-通路网络，使用内置Network Analyzer程序对生姜泻心汤治疗CRC网络进行拓扑分析，获得生姜泻心汤核心成分及作用靶点，结果见图5。预测黄芩素(连接度为21，中介中心度为0.078 817 27，接近中心度为0.486 590 04)、柚皮素(连接度为19，中介中心度为0.039 005 85，接近中心度为0.465 201)、刺芒柄花素(连接度为15，中介中心度为0.014 397 87，接近中心度为0.468 635)、1-甲氧基菜豆素(连接度为14，中介中心度为0.009 665 96，接近中心度为0.461 818)为生姜泻心汤治疗CRC的主要活性物质。PTGS2在网络中连接度为62，中介中心度为0.245 623 5，接近中心度为0.613 526 57，预测PTGS2为生姜泻心汤治疗CRC的最主要作用靶点。同样可能在该药理作用过程中起到重要作用的靶点为HSP90AA1、ESR1、AR、NOS2、PPARG、MAPK14、GSK3B、RXRA及ESR2等。

A.GO-BP分析；B.GO-MF分析；C.GO-CC分析；D.KEGG通路分析A.GO-BP analysis; B.GO-MF analysis; C.GO-CC analysis; D.KEGG-pathway analysis图4 生姜泻心汤治疗CRC的GO功能富集及KEGG通路富集分析Fig 4 GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of Shengjiang Xiexin decoction in the treatment of CRC

图5 生姜泻心汤成分-CRC-通路网络图Fig 5 Network diagram of ingredients of Shengjiang Xiexin decoction-CRC pathway

3 讨论

2007—2017年，我国是恶性肿瘤发病率增幅最大的国家，年均增幅>2%。CRC死亡率在全球恶性肿瘤中居第2位，2017年，全球CRC新发病例从130万例增至180万例，死亡89.6万例。2007—2017年，CRC新发病例增加了38%[1]。随着人们生活水平的不断改善及生活方式的变化，特别是膳食结构的改变，我国CRC的发病率和死亡率均呈升高趋势，且城市地区远高于农村。多数患者确诊时已属于中晚期。目前，针对CRC，尚没有安全、有效的防治办法。

在我国古代的经方经典中，并没有对于“CRC”这一病名的记载。根据其症状及发病部位可总结归纳为“肠覃”“肠风”“肠僻”“肠积”“锁肛痔”及“癥瘕”等[10]。中医认为，CRC的病因为正气亏虚加之饮食、情志变化，从而导致湿热下注、气滞血瘀，久则成疾。邱佳信总结历代著名医者的观点，提出“有瘤必体虚，有虚首健脾”的观念[11]。CRC的病性本虚标实，诸多临床案例及实验结果表明，CRC发生发展的关键是全身气机升降失调。以通为补、调畅气机和养脾调胃是治疗CRC的基本治则。同时，中医“未病先防”与“病后防变”的诊疗思想能更好地适用于CRC的防治。

本研究通过网络药理学方法，初步筛选出生姜泻心汤治疗CRC的活性成分为黄芩素、柚皮素及刺芒柄花素等。治疗CRC的机制基础研究结果表明，黄芩素能够诱导DNA片段化和染色质凝聚，进而阻断肿瘤细胞周期；还能够通过激活caspase-3和caspase-9蛋白，促进CRC细胞的凋亡[12]。此外，黄芩素能够通过抑制基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的活性显著抑制细胞迁移和侵袭[13]。柚皮素可以调控Notch信号通路，影响细胞中MMP-2和MMP-9的表达，抑制CRC细胞增殖、侵袭能力；并通过阻滞S期和G2/M期细胞周期，抑制人CRC细胞生长，促进细胞凋亡[14]；同时，其能够增强CRC细胞对DNA药物的敏感性[15]。刺芒柄花素通过抑制结肠癌细胞ERK1/2磷酸化，进而调控细胞的增殖分化，阻断恶性肿瘤血管生成过程[16]。刺芒柄花素能够调节miR-149及其直接基因靶标EphB3的表达，抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭[17]。因此，推测生姜泻心汤治疗CRC主要通过黄芩素、柚皮素和刺芒柄花素等发挥药效。

生姜泻心汤治疗CRC的靶点主要集中在PTGS2。PTGS2在许多恶性肿瘤中的表达均上调。PTGS2表达上调与肿瘤细胞血管生成过程显著相关。此外，PTGS2的代谢产物PGH2被前列腺素E2合酶转化为PGE2，进而促进恶性肿瘤疾病进展[18]。HSP90AA1与肿瘤细胞周期、凋亡、侵袭和分化紧密相关，是治疗CRC的关键蛋白。研究结果发现，多种恶性肿瘤患者体内的HSP90AA1水平显著升高，虽然HSP90AA1主要是细胞质蛋白，是一种调控细胞内稳态的介质，但其影响多种核过程，包括转录、染色质重构和DNA损伤诱导的突变，进而影响肿瘤疾病的发生发展[19]。生姜泻心汤治疗CRC的信号通路主要集中在恶性肿瘤、CRC相关通路等。与PI3K-Akt信号通路、蛋白多糖信号通路、细胞凋亡通路及IL-17信号通路等通路密切相关。CRC由结直肠上皮细胞产生，这是特定致癌基因和抑癌基因中遗传改变积累的结果。目前在CRC的研究中已发现了2种可能机制：(1)由一系列遗传变化导致的染色体不稳定性，这些变化涉及致癌基因(如K-ras)的激活和抑癌基因(如p53、DCC/Smad4及APC等)的失活[20]；(2)被称为微卫星不稳定性，DNA错配修复基因MLH1和(或)MSH2的启动子发生超甲基化而引起失活和编码微卫星的基因发生二次突变(TGF-RII、BAX等)共同导致这一生理过程[21]。上述2种机制均富集于PI3K-Akt信号通路。因此，推测生姜泻心汤可能通过调控PI3K-Akt信号通路从而发挥治疗CRC的作用。

本研究结果表明，生姜泻心汤能够调控多种CRC相关靶点进而参与并影响不同的生物学过程及信号通路，体现了传统中医药多功能、多靶点的优势和作用特点。本研究结果为目前临床治疗CRC提供了一条崭新的思路，并为探讨生姜泻心汤用于防治CRC的潜在作用机制提供了新的方向。但是，基于网络药理学研究药物治疗疾病的靶点仍存在局限性，目前尚未有基础研究验证其可靠的相关性。因此，后续将根据本研究结果，更进一步进行体内、体外试验验证，明晰生姜泻心汤治疗CRC的药理作用及相关机制。