冠状病毒疫苗研究进展及2019新型冠状病毒疫苗研发展望

张明顺，吉宁飞

1南京医科大学基础医学院免疫学系，2国家卫生健康委员会抗体技术实重点验室，江苏 南京 211166；3南京医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 210029

2019年12月，新型冠状病毒（2019 novel corona⁃virus，2019⁃nCoV）从武汉海鲜市场开始在人群中扩散［1］，截止2020年2月19日24时，2019⁃nCoV感染累计确诊74576 例，死亡2118 例（信息来自国家卫生健康委员会官方网站）。中国国家卫生健康委员会将2019⁃nCoV 引起的疾病统称为新型冠状病毒肺炎。世界卫生组织（WHO）将2019⁃nCoV 引起的疾病称为2019 冠状病毒病（coronavirus disease 2019，COVID⁃19）［2］；2019⁃nCoV 可能不仅仅引起肺部损害，还可能引起消化道感染［3］和其他脏器损伤。世界病毒分类委员会将2019⁃nCoV命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2 型（severe acute respiratory syn⁃drome coronavirus 2，SARS⁃CoV⁃2）［4］。国内外对于将2019⁃nCoV命名为SARS⁃CoV⁃2尚有一定争议，建议修正为2019 人类冠状病毒（human coronavirus 2019，HCoV⁃19）［5］。本文用2019⁃nCoV 指代2019新型冠状病毒。

冠状病毒是单正链RNA包膜病毒，广泛存在于自然界中。人类冠状病毒如229E、OC43、NL63 和HKU1 等一般引起轻中度的呼吸道感染症状［6］。2002 年，严重急性呼吸综合征（severe acute respira⁃tory syndrome，SARS）冠状病毒（SARS⁃CoV）在国内爆发［7］，WHO 估计SARS 确诊8098 例，死亡774 例，病死率近10%［8］。2012年，中东呼吸综合征（middle east respiratory syndrome，MERS）冠状病毒（MERS⁃CoV）在沙特等地爆发［9］，WHO估计MERS确诊1879例，死亡659 例，病死率高达35%［10］。不同于SARS和MERS 症状典型，2019⁃nCoV 感染后部分感染者无症状，无症状感染者影响了对2019⁃nCoV 病死率的估算。在1099例病原学确诊病例中，死亡15例，病死率1.4%［11］，低于SARS或者MERS。

传染性疾病的防控三原则是控制传染源、阻断传播途径和保护易感者。疫苗是保护易感者、阻断传染性疾病传播的有效手段，疫苗的发展和应用是现代文明的重要特征。从疫苗的组成和工作原理区分，疫苗有多种类型：传统疫苗（灭活疫苗、减毒活疫苗）、亚单位疫苗、重组载体疫苗、DNA 疫苗以及RNA疫苗等。本文旨在回顾SARS⁃CoV和MERS⁃CoV 传统疫苗、亚单位疫苗和DNA 疫苗研究进展，并以此展望2019⁃nCoV疫苗研究。

1 灭活疫苗

2002 年11 月，SARS 爆发；2003 年4 月，分离得到SARS⁃CoV 病毒株［12］。2004 年9 月，暨南大学报道，福尔马林灭活疫苗接种Balb/c小鼠，诱导出高滴度SARS⁃CoV 抗体［13］。2005 年5 月，中国科学院武汉病毒所报道，应用福尔马林灭活的SARS⁃CoV 疫苗接种猕猴，可以安全有效地诱导出中和抗体。但遗憾的是，SARS⁃CoV 猕猴感染模型症状不典型，实验没有能够回答灭活疫苗是否有保护效果［14］。2007年2月，北京中日友好医院报道，β⁃丙醇酸内酯灭活的SARS⁃CoV 疫苗接种健康受试者后，可诱导有效的免疫应答［15］。雪貂是流感病毒研究的模式动物，感染SARS⁃CoV 后，雪貂出现发热、流鼻涕和喷嚏等SARS典型症状。在雪貂感染冠状病毒模型中，福尔马林灭活疫苗可以诱导出SARS⁃CoV抗体，疫苗接种动物的排毒时间缩短1 周［16］。与SARS⁃CoV疫苗研究历程类似，2012年MERS爆发，2016年MERS⁃CoV 灭活疫苗接种小鼠［17］，虽然灭活疫苗成功诱导出中和抗体，但是灭活疫苗接种后的小鼠，肺脏出现超敏反应损伤，提示灭活疫苗可能不是有效防控MERS 的候选疫苗。2020 年1 月24 日，浙江省疾病控制中心分离得到2019⁃nCoV病毒株。病毒株分离成功，给传统疫苗（灭活疫苗、减毒活疫苗）的制备带来了曙光。

虽然目前2019⁃nCoV 的免疫发病机制尚不明确，但我国有SARS 灭活疫苗研发的丰富经验。在分离出2019⁃nCoV 病毒株的基础上，我们应该尝试2019⁃nCoV 灭活疫苗方案，包括：（1）分离更多的2019⁃nCoV病毒株进而选择合适的病毒株作为疫苗株；（2）建立病毒的大规模培养及灭活方案；（3）免疫佐剂的使用及小鼠等动物实验以验证安全性和免疫原性。2019⁃nCoV灭活疫苗是否能够安全有效的诱导免疫应答，尚需临床实验进行评价。

2 亚单位疫苗

灭活疫苗成分复杂，含有病毒体的多种结构蛋白和非结构蛋白。亚单位疫苗组成简单，一般仅含有一种或者几种病毒蛋白，不需要病毒的培养与灭活，生物安全性相对更高。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）亚单位疫苗通过重组病毒蛋白乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）可诱导中和抗体，HBsAg亚单位疫苗接种有效阻断了HBV在中国的传播，证明了亚单位疫苗的免疫效果。

冠状病毒重要结构蛋白刺突蛋白（spike，S），与病毒进入易感细胞密切相关，其近N端的S1功能结构域含有受体结合区（receptor binding domain，RBD），与细胞表面的血管紧缩素转化酶2（angioten⁃sin⁃converting enzyme 2，ACE2）结合，通过近C 端的S2 功能结构域与细胞膜融合，介导病毒进入细胞。与SARS⁃CoV 比较，2019⁃nCoV 的S 蛋白尤其是RBD 有4 个氨基酸突变，但S 蛋白仍可与ACE2 有效结合［18］。体外细胞实验证明，ACE2是2019⁃nCoV的识别受体［19］。冷冻电镜观察发现，2019⁃nCoV的S蛋白胞外区结构与SARS⁃CoV 高度相似［20］，但2019⁃nCoV 的S 蛋白与ACE2 的结合力更高，这可能是2019⁃nCoV高传染性的原因之一。遗憾的是，SARS⁃CoV的中和抗体S230等不能有效结合2019⁃nCoV的S 蛋白，提示解析2019⁃nCoV 的S 蛋白中和表位、研发S蛋白亚单位疫苗的必要性。

SARS⁃CoV 主要有S 蛋白、膜蛋白（membrane，M）、核衣壳蛋白（nuclear，N）和以及3a 蛋白等结构蛋白［21］。M 蛋白和3a 蛋白也可以诱导中和抗体，N蛋白可以通过交叉提呈诱导CD8+T细胞活化。需要注意的是，病毒蛋白具有多种生物学功能，如3a 蛋白可以下调Ⅰ型IFN 通路降低抗病毒免疫［22］，活化炎症小体增强炎症性损伤。根据基因组测序信息，2019⁃nCoV 可能包括S 蛋白、M 蛋白、N 蛋白、E 蛋白以及1ab/3/7/8/9/10b/13/14 等12 种结构蛋白［23］。针对这些结构蛋白功能与免疫原性进一步分析，将有助于2019⁃nCoV亚单位疫苗的研发。

3 DNA疫苗

相较于亚单位疫苗，DNA疫苗在体内表达病毒蛋白抗原，模拟了病毒蛋白在宿主细胞内的表达，可以更好地保持病毒蛋白的天然构象表位。DNA疫苗在宿主细胞中表达病毒蛋白，可以诱导相对平衡的细胞免疫应答和体液免疫应答。传统疫苗需要培养完整的病毒颗粒，亚单位疫苗则需要表达和纯化目的蛋白，而DNA疫苗只需要制备含有抗原基因序列的表达质粒，制备工艺简单。早于SARS⁃CoV 灭活疫苗（2004 年9 月）［13］，2004 年4 月已有研究报道，编码SARS⁃CoVS蛋白的DNA疫苗在小鼠体内可诱导细胞免疫应答和中和抗体［24］。更重要的是，在SARS⁃CoV攻毒实验中，接种DNA疫苗小鼠体内的SARS⁃CoV 基本被完全清除，显示DNA 疫苗具有强大的保护效果。2008年11月，SARS⁃CoVS蛋白DNA疫苗在I期临床实验中诱导出保护性细胞免疫应答和中和抗体［25］。SARS⁃CoV的结构蛋白，如N蛋白和M蛋白等，在DNA疫苗研究中也有报道［8］。有趣的是，M 蛋白能比S 蛋白更有效地诱导中和抗体和细胞免疫应答。MERS⁃CoVS 蛋白DNA 疫苗是首个进入Ⅰ期临床的MERS 疫苗，研究结果显示其在小鼠、骆驼和猕猴中具有较好的免疫原性，并在肺部感染模型中能够保护猕猴不受MERS病毒感染的影响［26］。Ⅰ期临床实验结果显示，大部分受试者能够检测到疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫反应，不良反应轻微且自限［27］。

制备2019⁃nCoV DNA 疫苗需有两个重要前提；第一是基因组信息，尤其是病毒蛋白基因编码序列；第二是病毒的生物学特征和疾病的发病机制。2019⁃nCoV病毒的生物学特征和疾病发病机制的阐明，有助于指导选择病毒蛋白作为适合的DNA疫苗抗原。随着209⁃nCoV 的生物学特征和疾病发病机制研究的深入，同时参考SARS⁃CoV 和MERS⁃CoV疫苗的研究经验，我们可以优先选择S 蛋白和（或）M 蛋白、N 蛋白等制备单价或者多价DNA 疫苗。目前分离得到的2019⁃nCoV不同病毒株的基因组序列高度一致。随着感染在人群中的不断扩散和可能发生的病毒免疫逃逸，2019⁃nCoV 是否会发生突变进而改变靶抗原的免疫原性？参考HIV⁃1 DNA 疫苗研究经验［28］，可以考虑在2019⁃nCoV DNA 疫苗中包括多个冠状病毒株的S蛋白编码序列从而更好地诱导广谱中和抗体。

4 对2019新型冠状病毒疫苗研发的思考与展望

4.1 安全性和有效性

对疫苗接种安全性的担忧，首先来自于疫苗本身。灭活疫苗，接种剂量大，可能会引起发热等；减毒活疫苗，在接种体内复制，可能在免疫功能异常个体引起严重后果。在Ⅰ期临床实验中，健康志愿者可以耐受SARS⁃CoV 灭活疫苗［15］，提示冠状病毒灭活疫苗是安全的。2019⁃nCoV 与SARS⁃CoV 亲缘关系近，即便如此，在获得2019⁃nCoV灭活疫苗安全有效的直接证据之前必须时刻谨慎。亚单位疫苗是在体外表达、纯化的病毒蛋白，不利于保持蛋白的构象表位；且亚单位疫苗一般免疫原性比较弱。对于DNA疫苗安全性最大的担忧，来自于其可能随机整合到宿主基因组上。近30年的DNA 疫苗研究已经充分证明了DNA 疫苗人群接种的安全性。DNA疫苗在人体内的免疫效果比较弱，采用DNA疫苗初次免疫、蛋白质疫苗加强免疫等免疫策略，可以有效增强DNA 疫苗的免疫效果［28］。DNA 疫苗与亚单位疫苗的联合应用，或许是2019⁃nCoV 疫苗的研究方向之一。

2019⁃nCoV 患者的血清中含有能阻断病毒感染的中和抗体［19］；康复期患者血浆能够快速降低2019⁃nCoV 患者病毒载量，有效缓解临床症状。但是，疫苗接种后引起的免疫应答也是双刃剑，抗体既可能结合病毒受体阻断病毒传播，也可能结合Fc受体促进病毒感染，如SARS⁃CoV的S蛋白单克隆抗体可促进巨噬细胞感染［29］；猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV，猫冠状病毒）S蛋白的单克隆抗体可能促进病毒巨噬细胞感染［30］；MERS⁃CoV 灭活疫苗诱导超敏反应而加重肺部损害［17］。随着对2019⁃nCoV 致病机制的进一步了解，将有助于选择更安全有效的疫苗株和靶抗原。

4.2 牛痘苗是否有助于2019 新型冠状病毒疫苗的研究

历史上最成功的疫苗是牛痘苗，消除了人间天花病毒的传播。牛痘苗的本质是感染牛的天花病毒，具有种属特异性。牛痘苗诱导交叉性保护免疫应答，受试者获得抵抗天花病毒感染的免疫保护力。在动物中，也有各种冠状病毒［31］，如FIPV、血凝性脑脊髓炎病毒（hemagglutinating encephalomyelitis virus，HEV，猪冠状病毒）、传染性支气管炎病毒（in⁃fectious bronchitis virus，IBV，禽冠状病毒）以及小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV，鼠冠状病毒）。这些动物冠状病毒也有种属特异性。人类与猫/猪等共存了千年，FIPV/HEV 等的安全性是否与牛痘苗相当？更关键的是，FIPV/HEV 是否可能会诱导交叉性保护应答?目前动物冠状病毒减毒疫苗已经在畜牧业中得到了有效应用，这些冠状病毒减毒疫苗是否有助于对阻断2019⁃nCoV传播？这些问题值得进一步探讨。

4.3 2019⁃nCoV疫苗何时问世

虽然2019⁃nCoV 尚未构成世界疫情大流行，但是其传播性已经远远超过了SARS⁃CoV。2004年之后，SARS 仅有新加坡的实验室感染报道［32］。SARS“消失”了，完成了Ⅰ期临床实验的SARS⁃CoV 灭活疫苗因此也失去了历史使命。鉴于2019⁃nCoV 与SARS⁃CoV的亲缘关系，尘封已久的SARS⁃CoV灭活疫苗是否可以诱导出针对2019⁃nCoV的交叉免疫保护还有待进一步研究。如果直接使用SARS⁃CoV灭活疫苗来预防2019⁃nCoV，那么疫苗的研制和临床应用将是最快捷的。否则，从SARS和MERS疫苗的研究历史来看，2019⁃nCoV 疫苗必须历经动物实验和临床实验，不可能一蹴而就。从2002 年SARS 爆发近20 年来，中国的科研能力已得到长足发展，相信并期待科研工作者能早日成功研制出2019⁃nCoV疫苗，为我们战胜2019⁃nCoV传播提供战略性武器。