肝脏淋巴管新生在肝纤维化进展中的作用

石 纳，陈修利，吴 昊，毛靖伟

大连医科大学附属第一医院 消化内科，辽宁 大连 116011

肝纤维化的发展是一个持续应对慢性肝损伤的愈合过程，其特点是基质蛋白产生增加且基质重塑失衡[1]。血管生成是机体损伤愈合反应的主要特征，而损伤愈合的慢性持续激活是慢性肝脏病发展的重要机制[2]，因此，血管生成与肝纤维化密切相关。与此同时，肝硬化门静脉高压往往伴有腹水，且腹水与肝硬化程度相关，肝硬化腹水的形成、代谢与肝脏淋巴系统密不可分[3]。肝脏微环境的改变能够引起包括淋巴液产生、淋巴管新生、淋巴液含量以及引流淋巴结内免疫反应等一系列变化。肝硬化及其前期肝纤维化可伴有肝脏淋巴系统功能及结构的改变。肝纤维化过程中肝脏汇管区伴有明显的淋巴管新生，而且新生淋巴管的数量与肝纤维化严重程度相关。淋巴管新生过程中，肝脏Kupffer细胞、淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells, LyEC)的功能及状态能够影响肝纤维化的发展。以下就淋巴管新生的分子机制及其在肝纤维化中的作用展开综述。

1 淋巴管标志物及其在肝脏内的表达

淋巴管系统是由封闭的毛细淋巴管和较大的收集淋巴管构成，毛细淋巴管由单层LyEC组成。淋巴管标记通常指LyEC上特定的物质，目前公认的标志物有：淋巴管透明质酸受体1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1, LYVE-1)、果蝇同源盒基因转录因子1(prospero homeobox-1, Prox-1)、肾小球足细胞膜黏蛋白(Podoplanin)以及血管内皮细胞生长因子受体3 (vascular endothelial growth factor receptor-3, VEGFR-3)。由于LYVE-1和Prox-1也分别在肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)和肝细胞中表达，因此，未来需要鉴定出在肝脏中更特异性LyEC标志物。

1.1 淋巴管透明质酸受体1(LYVE-1) LYVE-1广泛分布在淋巴管内外腔面，参与LyEC从组织摄取并转运透明质酸盐进入淋巴液的过程，其还参与部分白细胞和肿瘤细胞的淋巴结归巢[4]。LYVE-1在巨噬细胞、脾窦状内皮细胞、肺脏及肾上腺血管内皮细胞中也表达[5]。在肝组织中，LYVE-1不仅在LyEC中表达，在肝细胞及LSEC上也分别有表达[6]。LYVE-1在人肝细胞癌中的表达水平与患者总体生存率相关[7]。在慢性肝炎和肝硬化中，LYVE-1在LSEC的表达减弱，特别是在活动性炎症或纤维化病变附近的区域，LYVE-1在LSEC表达的减弱与肝病的进展有关[8]。

1.2 果蝇同源盒基因转录因子1(Prox-1) Prox-1是一种保守的同源异型核转录因子，它在胚胎形成以及在神经系统、眼、肝脏、胰腺、淋巴管和心脏等组织器官的生长发育中发挥重要作用[9]。Prox-1是LyEC从胚胎静脉分化的早期步骤的关键转录因子，对于淋巴管系统的发展必不可少[10]。Prox-1主要在细胞核中表达，其表达对内皮细胞向淋巴管系统定向分化、淋巴管内皮囊的出芽至关重要。Prox-1也可表达于肝细胞，并在早期肝形态发生过程中调节肝细胞迁移。正常胆管细胞Prox-1表达为阴性，而在肝硬化的纤维化间隔内、胆管细胞癌和肝癌的胆管上皮细胞表达呈阳性[11]。Shimoda等[12]发现Prox-1表达与肝细胞癌分化评分之间存在显著相关性，Prox-1在肿瘤中的低表达与不良预后密切相关，其可能作为肝癌诊断和治疗的靶点。

1.3 肾小球足细胞膜黏蛋白(Podoplanin) Podoplanin是一种存在于肾小管膜上皮细胞上的黏液样跨膜糖蛋白，主要表达在人肾足突细胞、肺Ⅰ型上皮细胞和成骨细胞以及LyEC，但仅出现在小淋巴管，其表达受Prox-1的调控[13]。Podoplanin是C型凝集素受体CLEC-2的配体，在血小板和免疫细胞中高度表达并促进血小板的聚集和激活[14]。Podoplanin基因完全敲除小鼠在出生时因呼吸衰竭死亡，同时伴有先天性淋巴管缺损而引起的淋巴水肿；Podoplanin杂合子仅表现为部分淋巴管发育不完全，但能够健康存活[15]。在肝硬化失代偿期患者肝组织中，Podoplanin表达阳性的淋巴管明显增多；在原发性胆汁性肝硬化患者肝脏中，Podoplanin表达阳性的成纤维网状细胞显著增加[6,16]。

1.4 血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR-3) VEGFR-3属于受体酪氨酸蛋白激酶家族的淋巴管内皮标志物，为血管内皮细胞生长因子(VEGF)C的特异性受体，在淋巴管生成中起关键作用。VEGFR-3主要表达于LyEC，激活VEGF-C/VEGFR-3信号通路能够诱导LyEC的增殖和迁移，并调节淋巴管新生[17]。VEGF-C与VEGFR-3结合后，使得VEGFR-3二聚体化并增强细胞质中络氨酸激酶磷酸化，导致下游信号如丝裂原活化蛋白激酶以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)传导增强，引起细胞效应。在胆管结扎后导致胆汁淤积的大鼠肝脏中VEGFR-3表达增加[18]。原发性胆汁性肝硬化的肝细胞也表达VEGF-C及VEGFR-3，推测其与肝纤维化及血管新生有关[19]。目前认为，VEGFR-3并不作为特异性LyEC标志物，但其可与其他标志物合用以提高LyEC检出率。

2 淋巴管新生的主要途径

淋巴管新生主要包括3种途径。(1)原有淋巴管在以出芽方式形成新的淋巴管：VEGF-C/VEGFR-3信号是淋巴管持续出芽和迁移过程的重要刺激因素，VEGF-C对于淋巴管的出芽必不可少[17]。(2)外周血管内皮祖细胞迁移至局部组织并转分化为LyEC：血管内皮祖细胞从胚胎静脉迁移同样依赖VEGF-C；但VEGF-C未与VEGFR-3结合的情况下，VEGF-C也可以通过其他受体如神经纤毛蛋白2结合进而介导淋巴管萌发和迁移[20]。(3)单核巨噬细胞在VEGF-C等因子作用下向LyEC转分化[21-22]。但在肝纤维化过程中，Kupffer细胞能否诱导转分化为LyEC尚未明确。

3 淋巴管新生与肝纤维化

淋巴管新生除了参与肿瘤转移、炎症、伤口愈合及器官移植等过程外，其在组织及器官的纤维化过程中也起重要作用。淋巴管能够通过回流组织间的渗出液，维持组织液的动态平衡；LyEC也可通过趋化因子及与受体结合等方式介导免疫细胞的招募与归巢，从而调节免疫反应[23]。肝脏是最大的淋巴液生成器官，肝脏中的淋巴管也起着维持体液平衡和调节免疫系统的作用。急性肝损伤过程中，VEGF-C/VEGFR-3信号的激活增加了淋巴管生成和修复性巨噬细胞的数量，两者通过减轻缺血/再损伤，有助于肝损伤修复[24]。而在慢性肝硬化及纤维化患者肝脏内淋巴液生成大幅度增加，伴随大量淋巴管新生，继而引发肝脏内免疫反应，参与纤维化过程[25]。

3.1 淋巴管新生在肝纤维化中的作用 在肝纤维化进展过程中，由于中央静脉及汇管区的组织结构破坏，肝窦血流阻力增加，血浆成分渗漏增加，导致淋巴液的生成增多，腹水形成。淋巴液生成增多导致的腹水形成是肝纤维化及肝硬化患者体内肝脏淋巴系统紊乱的公认临床表现[6]。正常肝脏淋巴管所在汇管区分布大量巨噬细胞即Kupffer细胞，在病理状态下，LyEC与包括Kupffer细胞在内的免疫细胞相互作用介导免疫细胞在机体内的迁移，并促进机体的自身免疫耐受及增强保护性免疫功能[26]。因此，肝脏中的淋巴系统对于维持体液和免疫调节起到了关键作用。包括肝纤维化、肝硬化、病毒性肝炎、原发性胆汁性胆管炎和肝细胞癌在内的多种肝脏疾病均存在淋巴管数量的增加(即淋巴管新生)现象[6]。肝纤维化及肝硬化患者肝脏淋巴液生成显著增加，并伴随肝内大量淋巴管新生[25]。在肝纤维化、肝硬化以及特发性门静脉高压的肝脏汇管区内淋巴管数量与密度明显增加，而且新生淋巴管数量和管腔面积与门静脉周围纤维化的严重程度呈正相关[25]。与病毒性肝病类似，非病毒引起的慢性肝病患者脏组织内淋巴管密度也明显增加，并且与纤维化以及免疫细胞浸润的区域有关[26]。VEGF/VEGFR-3信号通路是淋巴管发育及新生的主要途径，肝纤维化的进展与肝细胞缺氧和脉管新生有关，而且肝脏中VEGF/VEGFR-3信号活化与微脉管的密度相关[27]。因此，现有证据表明淋巴管新生参与了肝纤维化的发生与发展。

3.2 Kupffer细胞在肝脏淋巴管新生中的作用 正常肝组织汇管区的淋巴管周围分布有Kupffer细胞，而淋巴管新生的肝纤维化区域也分布有相当数量的Kupffer细胞，因此，推测肝脏淋巴新生与Kupffer细胞相关。在不同局部微环境状态下，Kupffer细胞能够极化成不同的亚型，即 M1型和 M2型。M1型Kupffer细胞分泌促炎细胞因子，维持促进炎症发生、发展，产生活性氧诱导肝细胞凋亡，促进肝损伤的进展；M2型Kupffer细胞通过分泌IL-10 抑制炎症的发生以及通过精氨酸酶1将精氨酸分解成聚胺，参与合成和稳定细胞外基质，对组织的修复产生作用，使慢性炎症减轻[28]。极化的M1、M2巨噬细胞的表型在一定程度上可以在体内和体外逆转，Kupffer细胞通过M1型和M2型的不同极化状态影响肝脏的病理生理过程，Kupffer细胞持续的M1型极化促进了肝脏炎症和纤维化的启动及进展[29-30]。研究[31]表明，外源性VEGF-C可以通过调节炎症反应以及Kupffer细胞的极化，从而缓解缺血再灌注导致的肝损伤；同时，Kupffer细胞除了分泌VEGF-C，通过VEGF-C/VEGFR-3通路促进淋巴管新生外[32]，还可通过包括自噬在内的方式转分化为LyEC[33-34]，进而促进淋巴管新生。因此，Kupffer细胞通过不同的极化状态、分泌VEGF-C以及转分化为LyEC的形式参与肝脏淋巴管新生过程。但在肝纤维化过程中自噬将Kupffer细胞诱导为Ml还是M2型进而转分化为LyEC的机制尚不明确。

3.3 LyEC调控肝纤维化的机制 肝脏中的淋巴系统除维持体液平衡外，在免疫调节中也起关键作用，作为构成淋巴管基本结构的LyEC则负责执行免疫调节功能。LyEC调节免疫的方式包括：(1)通过表达细胞因子和黏附分子介导免疫细胞迁移；(2)LyEC能直接降低树突状细胞的成熟度及阻止T淋巴细胞增殖，在免疫反应中起负调控作用；(3)LyEC还可以通过表达多种免疫调节因子如TGFβ和一氧化氮来实施负向免疫调节功能；(4)LyEC缺乏共刺激分子的表达，而富含共抑制标记，例如细胞程序性死亡-配体1[35]。值得注意的是，包括肝纤维化在内的慢性肝脏病变的肝脏内LyEC高表达趋化因子CCL21，说明淋巴管新生尤其是LyEC可能在慢性肝病肝纤维化进展中涉及免疫细胞迁移、归巢等过程。

除了上述免疫调节功能外，LyEC还可以通过分泌功能参与肝纤维化过程。研究[3]发现，肝硬化大鼠体内LyEC通过上调内源性一氧化氮，引起以淋巴管平滑肌细胞覆盖降低为主要特征的淋巴管重构，而抑制LyEC分泌的内源性一氧化氮合酶可以改善淋巴管重构。LyEC通过合成及分泌内源性一氧化氮合酶、内皮素参与了肝纤维化/肝硬化过程[36]，尤其是内皮素通过RhoA/Rock以及 PI3K/AKT信号通路引起HSC的收缩、迁移、增殖、活化，促进肝纤维化的发生、发展[37]。脂肪性肝炎终末期的肝纤维化过程中，LyEC还能够分泌IL-13，除能直接促进肝纤维化外，可通过激活IL-13通路直接导致淋巴管Prox-1表达下降，引起淋巴管通透性增加，导致淋巴系统失平衡，从而参与肝纤维化过程[26]。

4 小结

总之，肝脏淋巴管新生与急慢性肝损伤、肝纤维化等病理状态密切相关。急性肝损伤时，淋巴管新生通过介导免疫细胞的迁移以及免疫负调控功能减轻炎症反应[1]；而当肝损伤因素持续并诱发肝纤维化及肝硬化时，淋巴管新生虽可以调节体液有助淋巴液回流，但持续的淋巴管新生与肝纤维化的进展相关。因此，淋巴管新生在肝病的不同阶段对于机体的影响不同，即在炎症起关键作用的肝病早期，增强淋巴管新生可以加速炎症消退，阻止疾病进展；而在慢性肝纤维化阶段，抑制淋巴管新生则可能是有益的。

目前，对淋巴管特异的分子标志物研究仍有限，而且缺乏有效的用于研究肝脏淋巴系统的体内体外模型和成像技术。此外，淋巴管新生在肝纤维化进程中的分子机制尚未完全清楚，有待进一步探讨。但是，从淋巴管新生的角度研究干预肝纤维化进展的潜在靶点，对防治及逆转肝纤维化甚至肝硬化，具有重要作用和意义。

作者贡献声明：石纳负责资料分析、撰写论文；陈修利、吴昊参与资料分析、修改论文；毛靖伟负责拟定写作思路、指导撰写文章并最后定稿。