罗汉松种子总黄酮含量测定*

刘欣宇，吕玉媛，林乐珍，黄增琼

（广西医科大学药学院，广西 南宁530021）

罗汉松实为罗汉松科罗汉松属植物罗汉松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don或短叶罗汉松Podocarpus macrophyllus（Thunb.）D.Don var.maki（Sieb.）Endl.的果实，由种子和花托组成，具有补肾益肺、大补元气功效，用于治疗心胃痛和血虚、面色萎黄[1]。罗汉松实含有多糖[2]、川芎嗪、石竹烯等化学成分[3]；罗汉松茎、枝叶中含有丰富的黄酮类化合物[4-5]和萜类化合物[6-7]。现代药理学研究表明，罗汉松提取物具有保护心脏、抑制胃癌细胞、调节血脂、抗氧化及保护肝脏作用[8-11]，可能与其所含黄酮类成分有关。目前，关于罗汉松种子中总黄酮含量测定方法的研究报道较少，尚无法确定其总黄酮的含量。本研究中采用紫外-可见分光光度法测定罗汉松种子中总黄酮含量，可为今后罗汉松实的质量标准研究及药理活性研究提供科学依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

万能粉碎机（无锡久平仪器有限公司）；XS-205DU型天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为十万分之一）；KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）；CD-UPH-Ⅱ-20T型超纯水器（成都超纯科技有限公司）；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试药

罗汉松种子采自广西北海，经广西医科大学药学院生药学教研室李琼讲师鉴定为正品，符合药典规定；芦丁对照品（成都麦德生科技有限公司，批号为RP190213）；氢氧化钠（天津市光复发展科技有限公司，分析纯）；亚硝酸钠（天津博迪化工股份有限公司，分析纯）；硝酸铝（天津市大茂化学试剂厂，分析纯，批号为20180502）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

对照品溶液：取芦丁对照品50 mg，精密称定，置烧杯内，加入30 mL 70%乙醇，超声溶解（功率为500 W，频率为40 kHz），转移至50 mL容量瓶中，以70%乙醇定容，摇匀，配制成质量浓度为0.951 4 mg/mL的芦丁贮备液，置4℃冰箱中保存，备用。取芦丁对照品20mg，精密称定，置烧杯内，加入40 mL 70%乙醇，超声溶解（功率为500 W，频率为40 kHz），转移至100 mL容量瓶中，以70%乙醇定容，摇匀，配制成质量浓度为0.199 8 mg/mL的芦丁对照品溶液，置4℃冰箱保存，备用。

供试品溶液：取罗汉松种子粗粉200 g，置圆底烧瓶中，加入6倍量70%乙醇，回流提取1 h，过滤，收集滤液；滤渣重复提取1次，合并2次提取液，减压浓缩，80℃烘干，得罗汉松种子乙醇提取物干膏，备用。称取罗汉松种子乙醇提取物干膏50 mg，置烧杯中，加入40 mL 70%乙醇，超声处理（功率为500 W，频率为40 kHz）30 min，溶液转移至100 mL容量瓶中，以70%乙醇定容，摇匀，即得，置4℃冰箱保存。

空白对照溶液：量取70%乙醇置25 mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.2 显色方法

取对照品溶液、空白对照溶液和供试品溶液各适量，置25 mL容量瓶中，精密加入5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀，静置6 min，最后加入4% NaOH溶液5 mL，以70%乙醇溶液定容，摇匀，静置15 min显色。

2.3 测定波长选择

精密量取芦丁对照品溶液0.2 mL、供试品溶液和空白对照溶液各0.3 mL，按2.2项下方法显色，以空白对照溶液调零，于190～700 nm波长范围分别扫描对照品溶液和供试品溶液。结果，两者于253 nm波长处均有最大吸收，故确定测定波长为253 nm。

2.4 方法学考察

线性关系考察：精密吸取质量浓度为0.199 8 mg/mL的芦丁对照品溶液0.08，0.10，0.14，0.18，0.22 mL，分别置25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，摇匀，得质量浓度分别为0.639，0.799，1.119，1.439，1.758μg/mL的系列标准溶液。按2.2项下方法显色。以显色后的空白对照溶液调零，于253 nm波长处测定吸光度值，以吸光度（A）为纵坐标、芦丁对照品溶液质量浓度（C，μg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程A=0.904 4X+1.073 3，r=0.997 3。结果表明，芦丁对照品溶液质量浓度在0.639～1.758μg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：取质量浓度为0.799μg/mL的芦丁对照品溶液，以显色后的空白对照溶液调零，重复测定6次。结果总黄酮吸光度的RSD为0.23%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取提取物干膏样品50 mg，共6份，精密称定，按2.1项下方法制备供试品溶液，精密量取0.1 mL，按2.2项下方法显色，以显色后的空白对照溶液调零，测定供试品溶液的吸光度。结果总黄酮平均含量为335.12 mg/g，RSD为1.20%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：精密吸取0.1 mL已知含量的供试品溶液，按2.2项下方法显色，室温放置，以显色后的空白对照溶液调零，测定供试品溶液在15，30，45，60 min时的吸光度。结果60，45，30 min内溶液吸光度值的RSD分别为5.05%，4.22%，0.75%（n=3），表明供试品溶液在30 min内稳定性良好。

加样回收试验：取提取物干膏（批号为20180702）25 mg，共6份，精密称定，分别加入质量浓度为0.951 4 mg/mL的芦丁贮备液8 mL，按2.1项下方法制备供试品溶液。各取0.1 mL供试品溶液，按2.2项下方法显色。以显色后的空白对照溶液调零，测定吸光度，计算加样回收率。结果见表1。

2.5 样品含量测定

取同批提取物干膏（批号为20180702）50 mg，共3份，精密称定，按2.1项下方法制备供试品溶液，各取0.1 mL，按2.2项下方法显色。以显色后的空白对照溶液调零，测定吸光度。结果黄酮平均含量为323.50mg/g，按干膏提取率14.42%计算，罗汉松种子中总黄酮含量为4.66%。

表1总黄酮加样回收试验结果（n=6）

3 讨论

3.1 提取方法选择

采用回流提取法提取罗汉松种子中的总黄酮，与超声提取法[12]相比，其对样品粒径没有严格要求，对仪器设备的要求相对较低，可用于大规模提取。提取溶剂的体积分数、料液比、提取时间、提取温度等均会对黄酮类化合物的提取效果产生影响[13]，后续可通过正交试验对提取工艺进行优化，以确定最佳提取工艺条件。

3.2 试验条件选择

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法可使黄酮类化合物开环生成查耳酮而显色[14]。本研究中发现，显色剂的用量和加入试剂后的放置时间对测定结果存在较大影响。因此，应控制好显色剂用量，并严格控制显色时间。经NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色后，芦丁在510 nm波长附近有最大吸收[15]。本研究中，经紫外扫描发现，芦丁对照品和提取物乙醇溶液均在253 nm波长处有最大吸收，而在510 nm波长附近无吸收峰。因此，选择253 nm为测定波长。稳定性试验结果显示，供试品溶液室温放置45 min后，稳定性较差，可能与加入氢氧化钠后反应产物结构不稳定和颜色发生改变有关。经测定，供试品溶液室温放置30 min稳定性较好，故采用该方法测定罗汉松种子中总黄酮含量时，样品溶液配制后需在30 min内完成。

3.3 方法评价

罗汉松种子挥发油中的川芎嗪可能是罗汉松实具有治心胃痛功效的主要原因。本研究结果显示，罗汉松种子中总黄酮含量较高（4.66%），具有进一步研究的价值。大量研究显示，黄酮类化合物具有抗氧化、调血脂、改善心肌供血、抗肿瘤、抗糖尿病、抗病毒等药理作用[16-19]。推测罗汉松实治心胃痛的功效还可能与其中所含的黄酮类成分有关。本方法操作简单，重复性良好，准确性较高，可作为罗汉松种子总黄酮的含量测定方法，也可为罗汉松实药材质量控制及相关药理学研究提供参考。