药用植物离体培养技术的研究进展及其应用前景

邝贤婷，谭 笑，陈思仪，刘淑霞，生书晶

（广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东广州 510225）

我国药用植物资源种类繁多，蕴藏量丰富。随着药用植物药理研究的深入，其应用也越来越广泛，日益受到世界医疗体系的认可。近年来，药用植物资源的社会需求不断增加，但是多数药用植物人工栽培生长周期长、繁殖系数低，再加上药用植物的药效成分多为次生代谢产物，其产量低且易受环境气候的影响，因此，很多药用植物资源难以满足社会需求。随着生物学研究的发展，植物离体培养技术越来越成熟，以此来解决药用植物的资源短缺问题，无疑具有重要的社会价值和现实意义。通过文献查阅，结合笔者对何首乌等药用植物的资源研究，概述了愈伤组织、细胞培养、不定根诱导以及毛状根体系等植物离体培养技术在药用植物资源保护和开发利用发面的研究。离体培养技术不但可以应用于药用植物的快速繁殖，还可以应用于药用植物有效成分的积累以及生物转化合成新的化合物；通过离体培养技术对次生代谢产物的代谢途径进行研究，可以从根源上提高次生代谢产物的含量，从而有助于缓解药用植物的资源危机。

1 药用植物离体培养技术的研究进展

1.1 愈伤组织

愈伤组织是植物细胞脱分化后形成的一种无定形状态的薄壁细胞，可以在短时间内分化形成幼苗，实现快速繁殖，从而克服药用植物人工栽培周期长、生长缓慢的难题。据统计，进行愈伤组织培养研究过的药用植物超过400 种[1]。人参自古被称为“百草之王”，具有广泛的药理作用，早在20 世纪60年代，就已经有了人参愈伤组织培养的报道[2]。但是由于人参愈伤组织生长较为缓慢，且其中的有效成分含量远低于天然植株，至今人们还在探索和优化人参愈伤诱导分化的条件，以便将其工业化生产。

1.2 细胞培养

植物细胞培养是指在细胞离开生命体的前提下，以单个细胞体或者若干个细胞体为单位进行悬浮培养[3]。植物细胞培养技术可以优化最佳的培养条件，在较短时间内大规模培养，从而缓解药用植物资源供应的难题。从20 世纪80年代至今，药用植物细胞培养一直是研究的热点，并取得一系列成果，如在人参、西洋参、紫草、红豆杉的研究上均取得了细胞悬浮培养的成功[4]。但是，由于植物细胞生长相对较慢，次生代谢产物的合成与积累需要一个漫长的过程，这个过程容易受到培养条件如传质、传氧等的影响，导致在多次传代后出现老化的现象，因此，对优质悬浮细胞系进行筛选和优化仍是目前研究的重点[5-6]。另外，细胞培养工业化的前提是合适的细胞培养反应器的制备，如何解决在细胞生长高黏度的状态下，以合适的剪切力搅拌，达到传质、传氧等最合适的植物细胞生长环境，是植物细胞培养工业化亟须解决的问题。

1.3 不定根

不定根一般是在植物器官受伤或激素、病原微生物等外界因素刺激下由植物的茎或叶上长出的根[7]。目前对药用植物不定根的研究还不太广泛，主要集中于几种以根茎入药的名贵药用植物，如丹参、三七、人参、柴胡、白术等。但是人参不定根中皂苷含量低，仍然是亟待解决的问题。其他药用植物的不定根研究尚处于起步阶段，如王梅等[7]通过向柴胡根离体培养体系中添加前体物质、诱导子等，探讨了不同处理对柴胡不定根合成柴胡皂苷的影响，建立了北柴胡不定根生产柴胡皂苷的离体培养体系。陈巍等[8]研究发现，蔗糖浓度、培养基pH 值、接种量等外界培养条件显著影响丹参不定根的生长及其次生代谢产物的合成。吴炯等[9]对白术试管苗不定根的诱导和离体培养进行了系统研究，并且发现不定根中含有与药用植物白术根茎中相同的各类化学成分。

1.4 毛状根

毛状根又称发根，是发根农杆菌侵染植株或某一器官组织而形成的。因毛状根具有培养体系生长迅速、效率高、遗传性状稳定等优点，已成为植物组织培养的研究热点。目前，已有100 多种植物的毛状根被成功诱导[10]，通过优化培养基、光照、pH 值、温度等物理因素以及添加外源激素、诱导子等化学因子，有些毛状根中的次生代谢产物含量甚至会超过原植株含量，具有重要的应用价值。陈观水等[11]建立了太子参毛状根的培养体系，为利用毛状根大规模生产药用有效成分奠定了基础。人参、三七、丹参、黄芪、当归、银杏等药用植物的毛状根利用也已经获得成功[12]。其中，人参毛状根已经实现了商业化大规模生产，且其产品大规模应用于制药、食品和化妆品行业[13]。但是，大部分药用植物毛状根体系的研究仍处在研究阶段，这是由于毛状根经过多次继代培养后会退化，其次生代谢产物的含量降低，因此，毛状根体系的优化和筛选仍然是目前研究的主要内容。

2 药用植物离体培养技术的应用

2.1 药用植物快速繁殖

由于人工栽培的药用植物大多生长周期较长，而市场对名贵中药材的需求日益增加，使得药用植物资源过度开发，一些珍惜药用植物濒临灭绝。例如早些年我国蕴藏量丰富的野生甘草已经灭绝[14]。其他名贵中药材如金花茶、人参和红豆杉已被列入国家一级保护野生植物名录，长此以往，将对传统医学造成冲击。利用离体培养技术分化成植株，可以实现药用植物的快速繁殖，从而解决濒危药用植物的资源问题。藏红花引种我国以来，多采用分球繁殖的方式，繁殖系数低、种球易受病毒侵害且易退化，限制了藏红花的大规模产业化种植[15]。针对该问题，经过多年的摸索，目前已经建立了藏红花花柱诱导愈伤组织的初代培养技术体系。据统计，目前已有200 多种药用植物经过离体培养成功获得了试管植株，实现了快速繁殖，其中绝大多数为珍贵稀有的药用植物[2]，如人参、铁皮石斛、金线莲等。

2.2 利用药用植物离体培养技术生产药用植物活性化合物

药用植物的活性产物往往是其次生代谢产物，生产周期长、产量低，利用离体培养技术生产药用植物活性成分具有重要的经济效益和社会效益。据统计，近1 000 种药用植物的离体培养技术获得成功，提供了超过600 种的活性成分，并且人参、紫杉醇、青蒿素的离体培养生产已经达到了工业化水平[1]。王娟等[16]综述了药用植物中次生代谢产物的积累，多种次生代谢产物如萜类、黄酮类、生物碱、蒽醌类、酚酸以及类固醇等都通过不同的离体培养技术得到生产，如可以用乌拉尔甘草悬浮细胞来积累黄酮类产物[17]、迷迭香悬浮细胞积累迷迭香酸[18]、雷公藤固定化离体细胞积累雷公藤甲素[19]、野葛细胞积累黄酮类[20]、银杏悬浮或者固定化细胞积累黄酮类和银杏内酯等[21]。研究发现，通过改变培养条件，如调整培养基的营养成分含量、调整pH 值和温度、添加外源激素、进行菌体感染等生物刺激，均能有效提高离体培养材料中活性成分的含量，这些研究为药用植物中次生代谢产物生产提供了有效的途径。

2.3 利用药用植物离体培养技术进行生物转化合成

生物体系中会存在各种各样的酶，而这些酶系统能够对外源性底物进行糖基化、羟基化、甲基化、氧化、还原等结构修饰，即为生物转化。由于多酶催化作用的不确定性，还可能产生一些新的活性物质。据统计，迄今已有超过40 种的植物细胞成功进行了生物转化[22]，其中悬浮细胞和毛状根体系应用较多。LIU 等[23]使用长春花悬浮细胞，将外源底物脱氢表雄酮转化成了13 个新的化合物。西洋参冠瘿组织细胞在添加丹皮酚和大黄素后，可以合成多种糖基化、羟基化和甲基化的活性衍生物[24]。韩健等[25]利用长春花及银杏植物细胞悬浮培养细胞分别成功地将青蒿素进行转化。由于悬浮培养细胞具有体细胞克隆不稳定的缺陷，长期生产会导致细胞活性降低，所以为了维持高产必须对细胞株进行不断筛选。毛状根转化系统也已经广泛应用于药物活性成分的生物转化研究。目前已有人参、西洋参、何首乌、长春花、红景天、石斛等药用植物进行毛状根生物转化的报道，如人参毛状根成功将毛地黄毒苷配基转化成5 种酯化产物以及6 种糖苷化产物[26]，何首乌毛状根体系可以转化青蒿素类、倍半萜类、瑞香素等一系列化合物[20]。离体培养技术在生物转化方面有着广阔的发展前景，对于充实新化合物资源，甚至研制开发新药都是一个可行的方法，值得进一步研究挖掘。

2.4 药用植物离体培养技术在次生代谢工程方面的研究

药用植物次生代谢工程是利用基因工程的手段对次生代谢途径进行修饰、调控甚至改变，以期提高次生代谢产物的含量。目前，虽然多数药用植物的次生代谢途径还未完全阐释清楚，但次生代谢途径中关键酶基因已有很多报道。LEE 等[27]、SHIBATA[28]构建了人参氧化鲨烯合成酶的超表达载体，转化人参毛状根后，其中所含的三萜皂苷比对照组明显提高；除了超表达研究，对人参皂苷合成的支路途经进行干扰，也能提高目的皂苷的含量。笔者前期研究表明，芪合酶是何首乌二苯乙烯苷合成途径的关键酶，将含有芪合酶基因的过表达载体和RNA 干扰载体导入野生型发根农杆菌ATCC15834 中，转化何首乌外植体诱导生成毛状根，结果表明，芪合酶过表达的何首乌毛状根中二苯乙烯苷含量是空白组的2.41 倍，而RNA 干扰组二苯乙烯苷合成明显减少[29]。

3 展望

药用植物离体培养技术日益提高，无疑成为解决药用植物资源短缺的有效手段。目前，除了人参细胞培养有工业化的报道以外，多数药用植物的离体培养还在实验室阶段。所以对离体培养的细胞进行优化和筛选，对离体培养条件甚至培养反应器进行优化设计，解决植物细胞传代后的老化问题，是药用植物离体培养工业化的前提条件。离体培养技术在药用植物的快速繁殖和有效成分的积累方面无疑具有明显的优势。通过离体培养技术对次生代谢产物的代谢途径进行研究，将可以通过基因调控的手段，从根源上提高次生代谢产物的含量，成为解决药用植物资源危机的有效手段，也为开拓药用植物的应用领域提供了广阔的前景。