布鲁氏菌毒力因子及致病机制研究新进展

秋叶红，李静波，李 响，翟景波，3

（1.内蒙古民族大学 医学院，内蒙古 通辽028000；2.通辽市科尔沁区妇幼保健院，内蒙古 通辽028000；3.内蒙古自治区布鲁氏菌病防治工程技术研究中心，内蒙古 通辽028043）

布鲁氏菌是胞内寄生的革兰氏阴性球状杆菌，可以引起以生殖系统疾病为主要特征的人畜共患病，在全世界广泛分布，目前该病波及了我国25个省（市、自治区），每年感染的羊、牛、猪高达百万头，造成的经济损失可达十几亿元人民币.布鲁氏菌侵入人体后，可累及多个组织器官形成慢性感染，难以治愈.笔者从布鲁氏菌毒力因子和致病机制两个方面，对布鲁氏菌的研究进展进行综述.

1 毒力因子

1.1 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）

普遍认为LPS是一种毒力因子，根据有两点：（1）布鲁氏菌LPS免疫原性差，不能激活补体系统，使其能够在吞噬细胞内存活繁殖；（2）LPS缺陷突变株对补体和多粘菌素B介导的溶菌作用较为敏感.Anne等研究证实，去除WboA基因的牛种布鲁氏菌变异株，其毒力要比原代菌株S2308明显减弱.布鲁氏菌S2308株的光滑型LPS具有潜在的免疫调节活性［1]，LPS分子可以不被巨噬细胞降解，并和MHC-II类分子形成复合物，维持布鲁氏菌在宿主巨噬细胞中长期生存.LPS分子的完整性决定了布鲁氏菌的毒力和胞内生存机制.

1.2 BvrR/BvrS双组分调控系统

布鲁氏菌双组分调控系统可以通过感应和处理环境信号来发挥调控作用，是一类重要的毒力调控系统.BvrR/BvrS 缺失突变株导致布鲁氏菌复制能力下降，不能有效抑制吞噬小体和溶酶体的融合，从而使细菌在进入细胞后被吞噬溶酶体消灭，BvrR/BvrS 双组分调控系统能够阻止溶酶体融合.另外，该系统可以增强布鲁氏菌在营养缺乏的环境中的生存能力，使其能在细胞内长期存活.

1.3 Cyclic-1-2-glucans（CβG）

布鲁氏菌CβG属Ⅱ型渗透调节的周质葡聚糖（osmoregulated periplasmic glucans，OPGS）家族.CβG通过作用于巨噬细胞表面的脂质筏，影响细胞内的物质运输，这些葡聚糖参与吞噬体-溶酶体融合的控制.CβG缺失的突变体无法阻止吞噬体-溶酶体融合，使细菌不能繁殖.此外，经CβG处理的突变体能够通过避免溶酶体融合来控制空泡成熟，使布鲁氏菌存活并到达内质网进而在此复制［2].

1.4 尿素酶（Urease）

尿素酶是一种金属蛋白酶，它将尿素分解为碳酸和氨形式，从而使pH值增加，此特征使其能够在酸性环境中存活［3].由1MB的DNA分离的染色体Ⅰ中有两个尿素-操纵子：ure-1和ure-2.ure-1和ure-2编码结构基因为尿素A、尿素B、尿素C和辅助基因：尿素D、尿素E、尿素F、尿素G［4].当布鲁氏菌通过口服途径进入宿主体内时，尿素酶可以保护其通过消化道［5].除牛种布鲁氏菌外的所有种属的布鲁氏菌都会产生尿素酶［6].

1.5 细胞色素氧化酶

细胞色素氧化酶是一种可以促进布鲁氏菌在巨噬细胞内存活的酶.由于在巨噬细胞内氧的利用受到限制，细胞色素cbb3氧化酶在体外表达［7]，并且能够使布鲁氏菌在缺氧组织中定植.细胞色素bd（ubiquinol oxidases）氧化酶在细胞增殖的过程中表达，在细胞复制的过程中对复制的微环境起到调节作用.缺乏此类细胞色素bd氧化酶的布鲁氏菌，在感染小鼠模型中高度衰减.

1.6 烷基过氧化氢还原酶（AhpC，AhpD）

这种酶起到防御氧自由基和活性氮的作用［8].在启动子的控制下，AhpC 和AhpD 被同一个操纵子调控.AhpC突变体对过氧化物灭活更加敏感而且更容易发生自发突变［9，3].

1.7 一氧化氮还原酶（Nord）

布鲁氏菌内的一氧化氮还原酶由四种类型的还原酶组成：NNR-亚硝酸盐还原酶，NAR-硝酸盐还原酶，NOR-一氧化氮还原酶和NOS-一氧化二氮还原酶.一氧化氮还原酶的产生有助于保护布鲁氏菌免受巨噬细胞内低氧环境的影响［3].

1.8 布鲁氏菌毒力因子A（Brucella virulence factor A，bvfA）

bvfA是仅在布鲁氏菌属中产生的周质蛋白，在基因序列数据库中没有同源序列.吞噬细胞酸化诱导bvfA表达，由此可推测该蛋白参与复制细胞内环境.目前bvfA的功能尚不明确［10].

1.9 T4SS

T4SS是由VirB操纵子编码的多蛋白复合物家族.布鲁氏菌入侵机体时T4SS能够调控大量毒力因子的诱导表达，产生多种效应子（VceA、VceC［11]等），有效地阻止溶酶体与吞噬小体融合，使布鲁氏菌适应不良的宿主胞内环境，克服和逃避巨噬细胞的各种防御机制，进而在吞噬细胞内生存复制.

1.10 外膜蛋白

外膜蛋白是布鲁氏菌重要的抗原和毒力因子，特别是在粘附侵袭过程中起到了重要作用.Omp19能够稳定布鲁氏菌外膜蛋白结构［11]，Omp25 是布鲁氏菌外膜的结构蛋白，与肽聚糖（PG）相关密切，其分子量大小为20KDa.使布鲁氏菌S2308、16M 和LSU99 的Omp25基因缺失，得到的缺失突变株，免疫BALB/c小鼠，并与野毒株比较.结果显示，野毒株的体内外存活能力及激发体液免疫能力均明显高于突变株，说明Omp25是布鲁氏菌的重要毒力基因［13].有报道称，Omp25与引发流产有关［14].Omp31 是布鲁氏菌的另一免疫保护性抗原，它具有维持外膜完整性的作用，同时也是一种潜在的血红素利用蛋白，与布鲁氏菌对铁的摄取有关.

1.11 应激反应蛋白

布鲁氏菌可以表达应激反应蛋白，用来适应不良的胞内环境，从而能够在巨噬细胞内生存繁殖.其中已经证实的应激反应蛋白有如下几种：

1.11.1 抗氧化物歧化酶SOD、H2O2酶 研究表明［15]，SOD在活体巨噬细胞内起作用.Fred M等人通过对牛种布鲁氏菌S2308毒力株和S19疫苗株Cu/Zn-SOD基因缺失研究表明，变异株在HeLa 细胞和J774细胞系中的存活和生长能力与它的亲本株相同，接种在BALB/c小鼠后，S19变异株恢复了向膜内感染的能力，而S2308 变异株接种BALB/c 小鼠与亲本株比较，其脾的重量明显轻于野生株感染鼠，这些结果表明，抗氧化物歧化酶在布鲁氏菌存活和致病性方面有主要功能.

1.11.2 热休克蛋白 dnaK是一种热休克蛋白和分子伴侣，参与毒力因子的折叠和正确定位，具有修复蛋白的作用，有助于布鲁氏菌适应胞内恶劣环境.gorEL基因是一种分子伴侣，能够参与新生蛋白的正确折叠.周质蛋白酶HtrA是外周胞质的应激反应蛋白，阻碍高温及氧化剂对细菌的杀伤.该基因与逃避白细胞杀伤、在巨噬细胞中的复制及其毒力有关.

1.11.3 QS QS是一种细菌胞间信号传递系统，可以协调基因的表达，从而使细菌适应胞内环境、产生毒力因子.布鲁氏菌也含有QS系统，有VjbR和BlxR两个LuxR转录激活因子.胞内生存和小鼠体内存活实验表明，VjbR突变株在巨噬细胞内的生存能力下降，毒力减弱，与Rambow 等研究结果相符.另外，文献报道［16]VjbR 也可以通过调控鞭毛调控子FtcR 来调控鞭毛基因的转录.这些结果表明，QS与布鲁氏菌的毒力基因表达密切相关，可以通过对菌体信号作出应答，从整体水平上调控细菌的各种毒力因子.

2 致病机制

2.1 侵入巨噬细胞

在调理状态下，布鲁氏菌主要通过Fc 、补体或纤连蛋白受体被巨噬细胞摄取.而未受调理作用的布鲁氏菌通过已知和未知的受体分子（如FcR，C3Br）结合到细胞膜分泌位点，再通过脂质筏侵入巨噬细胞.布鲁氏菌感染巨噬细胞后，可激活cAMP蛋白激酶A途径，这对于布鲁氏菌在巨噬细胞内的生存及复制是必需的［17].有文献报道［18]，与野生株相比，BvrS/BvrR 突变株虽然可以与细胞结合，但是进入细胞的效率却明显降低.此外，当BvrS/BvrR 突变株的外膜结构发生改变并伴有外膜蛋白Omp25 和Omp22 的缺失以及脂多糖（LPS）的缺陷时，细菌即丧失入侵细胞的能力.这说明，BvrS/BvrR 双组分系统参与布鲁氏菌对吞噬细胞的侵袭［19，20].

2.2 侵入胎盘滋养层细胞

孕期妇女体内的布鲁氏菌与胎盘滋养层细胞表面的热休克蛋白70结合，其表面的IFN-γ可促进胎盘滋养层细胞对布鲁氏菌的吞噬作用［21]，布鲁氏菌在胎盘滋养层细胞中大量生长繁殖，感染胎盘使其完整性遭到破坏，最终产下带菌胎儿，严重者可导致流产.目前对胎盘滋养层细胞中的布鲁氏菌的致病形态还处于探索阶段.一些反刍动物可以在感染布鲁氏菌后产生糖醇类物质，刺激细胞内的布鲁氏菌生长和繁殖.

2.3 形成布氏小体（BCV）

布鲁氏菌毒力株侵入巨噬细胞后，吞噬小泡与巨噬细胞内的早期内吞网络相关环节发生相互作用，激活Rho家族的小GTP酶和中度募集丝状肌动蛋白，通过巨噬细胞上的某些受体分子使布鲁氏菌发生内化，这一过程持续30 min左右［22].布鲁氏菌此时定居在含有溶酶体相关膜糖蛋白及内质网标志物SecG1B阳性的囊泡中.大约1h以后，通过获得溶酶体相关膜蛋白LAMP21逐渐形成含布鲁氏菌的囊泡［23].感染4h后，巨噬细胞募集的一些抗菌因子已经杀灭近90%侵入巨噬细胞内的布鲁氏菌，仅有约10%能在巨噬细胞内生存、复制.这些幸存的布鲁氏菌在吞噬体内与内质网（ER）持续作用.感染24h后，含布鲁氏菌的吞噬体与ER的部分膜成分交换，获得ER的部分膜成分后成为BCV，极好的抵御了最初定位的细胞内的酸性环境，更加有利于布鲁氏菌长期生存和复制.

2.4 抑制巨噬细胞的活化和凋亡

布鲁氏菌感染巨噬细胞时，一方面通过阻断主要致炎细胞因子TNF-α分泌［24]，阻止感染巨噬细胞自分泌和旁分泌杀菌活性物质，这使得布鲁氏菌可以在天然免疫的炎症阶段由于TNF-α的缺乏而产生免疫耐受或偏移的特异性免疫应答.此外，通过提高细胞内cAMP的含量来抑制人巨噬细胞的活化.另一方面通过诱导抗凋亡基因A1的表达及激活凋亡抑制剂cAMP 和CREB 等方法，抑制巨噬细胞的凋亡［25].从而利用巨噬细胞内的营养物质生存复制，逃脱免疫系统的攻击.

3 结语

本文综述了布鲁氏菌毒力因子与致病机制的研究进展，布鲁氏菌含有多种不同的毒力因子，在感染过程中，毒力因子使抗原提呈细胞的吞噬能力降低，帮助布鲁氏菌在吞噬细胞和非吞噬细胞中生存繁殖.巨噬细胞是布鲁氏菌感染的靶细胞，布鲁氏菌通过攻击宿主单核巨噬细胞，削弱巨噬细胞的杀伤功能，使巨噬细胞的抗原提呈功能部分丧失，通过改变抗原提呈细胞的内环境，长期存在于细胞中复制和繁殖，引发慢性感染.随着分子生物学技术的发展，布鲁氏菌的致病机制在分子水平上将会有更深入的成果.明确布鲁氏菌的致病机制有助于相关疫苗的研发，进一步实现布鲁氏菌病的预防与治疗.