蒺藜苜蓿膜联蛋白家族基因在非生物胁迫下的表达分析

程婕 徐柳根 邱涛涛

摘要 膜联蛋白（Annexin）是一种磷脂结合蛋白，目前有关蒺藜苜蓿膜联蛋白家族的研究较少。对蒺藜苜蓿膜联蛋白家族基因进行了生物信息学分析，确定了膜联蛋白家族基因的数量、结构域和进化关系。对蒺藜苜蓿的幼苗分别进行干旱、盐和冷处理，并利用高通量测序对20个蒺藜苜蓿膜联蛋白基因进行表达分析，结果表明：在干旱胁迫下，3个基因表达下调;在盐胁迫下，5个基因表达下调，4个基因表达上调;在冷胁迫下，3个基因表达下调。其中，MtANX3在各胁迫下均发生了下调。综上所述，非生物胁迫影响了蒺藜苜蓿模联蛋白家族基因的表达。

关键词 蒺藜苜蓿;膜联蛋白;非生物胁迫;基因表达

中图分类号 S188  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）21-0115-04

Abstract Annexin is a phospholipid binding protein. There are few studies on the Medicago truncatula annexin family. In this paper，bioinformatics analysis of M.truncatula  annexin family genes was carried out，and the number，domain and evolutionary relationship of annexin family genes were determined. The M.truncatula seedlings were treated with drought，salt and cold stress，and the expression of 20 M.truncatula annexin genes was analyzed by highthroughput sequencing. The results showed that under drought stress，3 genes were downregulated. Under salt stress，5 genes were downregulated and 4 genes were upregulated. Under cold stress，3 genes were downregulated. Among them，MtANX3 were all downregulated under various stresses. In summary，abiotic stress affects the expression of M.truncatula annexin family genes.

Key words Medicago truncatula;Annexin;Abiotic stress;Gene expression

基金项目 江西省教育厅科技计划项目（GJJ170276）。

作者简介 程婕（1994—），女，江西赣州人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。 *通信作者，教授，从事植物分子生物学研究。

收稿日期 2019-11-28;修回日期 2019-12-18

膜联蛋白是在1978年发现的一种Ca2+和磷脂结合型蛋白[1]，后续发现其能明显促进依赖Ca2+的胞吐作用[2-3]。膜联蛋白是一种多功能性蛋白，在生物体内分布很广，它可以分布在除酵母菌外的所有真核生物中。而根据生物种类的不同，膜联蛋白可以分为A、B、C、D、E五类。脊椎动物蛋白是A类，无脊椎动物蛋白属于B类，真菌和一些单核细胞生物被归属于C类，D类包含植物膜蛋白，原核生物属于E类[4]。不同膜联蛋白基因的表达模式以及蛋白质的亚细胞定位具有特异性[5-7]。

膜联蛋白在生物体内具有许多重要作用，但目前的研究主要集中在动物和植物上。在动物体内，已有研究证明，膜联蛋白具有参与细胞分泌[8]、生物膜的形成和调节离子通道的作用，还与细胞凋亡等生命活动有关[9]。目前，有多个研究膜联蛋白在癌症方面作用的内容，如发现在动物体内，膜联蛋白通过纤溶酶原产生纤溶酶，可以促进细胞外基质降解，促进细胞的迁移和肿瘤的侵袭[10-11]。

在植物方面，膜联蛋白基因在植物体生长发育的各个阶段均有表达[12]，也发挥了各种作用：参与细胞分泌、胞吐作用，与Ca2+形成离子通道，有一些还具有酶的作用[13-14]。植物膜联蛋白还参与调控植物代谢和生长发育并可以协同调节抗旱、耐盐等多种抗逆反应[15-17]，在干旱、冷害和高盐等非生物胁迫下，参与调控植物生命活动，且膜联蛋白的表达调控会因物种的不同而出現差异[18]。还有研究表明植物膜联蛋白与根毛和花粉的生长发育以及信号转导有关系[19-20]。

笔者鉴定了蒺藜苜蓿中膜联蛋白家族成员，并对其结构域和进化关系进行分析。最后，通过高通量测序分析了该家族基因在高盐、干旱和冷害胁迫下的表达情况。这一研究初步阐明了蒺藜苜蓿膜联蛋白家族的胁迫表达情况，将有助于在豆科植物中解析膜联蛋白在非生物胁迫下发挥的潜在调节作用，为该家族的基因功能鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 苜蓿培养与样品处理

用Hoagland营养液水培苜蓿4周。培养条件：光周期14/10 h（日/夜），温度22～24 ℃，光合有效辐射200 μmol/（m2·s）。分别进行干旱处理（将小苗置于滤纸），盐处理（300 mmol/L NaCl溶液）和冷处理（4 ℃）0、2、6、12 h。TRIzol法提取样品总RNA，送公司进行高通量测序。

1.2 苜蓿膜联蛋白家族基因鉴定

在PFAM数据库（http：∥pfam.xfam.org） 获得蒺藜苜蓿膜联蛋白基因家族的结构域模型（PF00191），利用Hmmer 3.0程序（http：∥hmmer.janelia.org/）进行比对、筛选。将筛选得到的候选基因到PFAM数据库中进行比对，确认最终的膜联蛋白。

1.3 苜蓿膜联蛋白基本信息和结构域分析

在蛋白质的数据库Swiss-Prot（http：∥www.uniprot.org/uniprot/？query=reviewed%3Ayes） 中获得膜联蛋白家族基因的基本信息，包括等电点、氨基酸数、相对分子质量等。从PFAM数据库中获得这20个基因的结构域图谱。

1.4 构建进化树和基因芯片图谱

首先，用ClustalW程序对膜联蛋白氨基酸序列进行比对，然后通过MEGA7程序，用邻接法（Neighbor-Joining）构建进化树，步长设为1 000。从苜蓿芯片网站（https：∥mtgea.noble.org/v2/index.php）获得已知芯片信息，用MeV4.0做成热图。

2 结果与分析

2.1 蒺藜苜蓿膜联蛋白的基本信息

通过HMMER软件在苜蓿蛋白数据库中比对搜索，然后通过PFAM网站确定，共发现了20个膜联蛋白。蛋白的氨基酸数分布在96～320，其中，MtANX14氨基酸数最少，只有96个;MtANX10最多有320个。蛋白的分子量分布在10.86～36.83 kD，而等电点分布在4.67～9.43，大部分等电点偏中性，等电点最大的是MtANX20，最小的是MtANX1（表1）。通过PFAM搜索发现，这20个蛋白质都含有ANX结构域，而不含其他结构域。

2.2 膜联蛋白的进化树分析

对蒺藜苜蓿膜联蛋白的20个基因进行系统分析。用ClustalW程序校对得到膜联蛋白的氨基酸序列，使用MEGA7.0用Neighbor-Joining格式构建进化树（图1）。从图中可以看出，MtANX5和MtANX17，MtANX18和MtANX19，MtANX1和MtANX9，MtANX3和MtANX11，MtANX12和MtANX13，这5对蛋白质之间的亲缘关系很近。

2.3 膜联蛋白家族基因在非生物胁迫下的差异性表达

为了探明膜联蛋白基因在非生物胁迫下的表达，分别对幼苗进行干旱处理，盐处理和冷处理0、2、6、12 h，提取总RNA，进行高通量测序。将胁迫处理与非处理的样品进行比较，如果不同胁迫处理时间点的表达变化一致，并且至少有一个满足条件|log2N|>1，就把它定义为差异表达基因。结果显示：MtANX4、MtANX9、MtANX15和MtANX16在盐胁迫中上调（表3）;MtANX3、MtANX5和MtANX10在干旱胁迫中下调（表2）;MtANX1、MtANX3、MtANX5、MtANX13和MtANX18在盐胁迫中下调（表3）; MtANX3、MtANX7和MtANX19在低温胁迫中下调（表4）。

2.4 膜联蛋白基因组织表达分析 为了分析苜蓿中膜联蛋白基因组织表达，从已知芯片数据库中下载数据，利用Mev4.0构建热图。结果显示：MtANX14和MtANX17在植物体各部分的表达都较低，MtANX5 、MtANX18、MtANX19和 MtANX20在植物的根和种子中表达较高，MtANX9在各组织中表达都较高。MtANX6、MtANX7、MtANX18、MtANX19和 MtANX20在根瘤中表达较高，而MtANX14和MtANX17在根瘤中表达很低（图2）。

3 讨论与展望

通过生物信息分析，首次鉴定了20个蒺藜苜蓿膜联蛋白。这20个蛋白的基本信息显示大部分蛋白的氨基酸数为300多个，并且等电点偏中性。这些特征可能与膜联蛋白发挥的细胞分泌、胞吐作用、与Ca2+形成离子通道等功能相关。通过结构域分析，发现这个家族蛋白的结构域非常单一，只有ANX结构域。这一结果说明该家族蛋白可能在功能上比较保守。通过进化树分析，发现这20个膜联蛋白有5组亲缘关系非常相近，这说明可能膜联蛋白存在着功能的冗余。

进一步通过高通量测序发现这些蛋白基因中有很多受到非生物胁迫的调控。在干旱胁迫下，3个基因表达下调;在盐胁迫下，5个基因表达下调，4个基因表达上调;在冷胁迫下，3个基因表达下调。其中，MtANX3在各胁迫下均发生了下调。说明非生物胁迫对膜联蛋白家族基因的表达有影响。

首次在豆科模式植物苜蓿膜中鉴定了膜联蛋白家族基因。这一研究将有助于进一步在豆科植物中阐明膜联蛋白在非生物胁迫下发挥的潜在的调节功能。

参考文献

[1]王立科，张边江，唐宁，等.植物膜联蛋白基因研究进展[J].分子植物育种，2016，14（8）：2060-2065.

[2]CARROLL A D，MOYEN C，VAN KESTEREN P，et al.Ca2+，annexins，and GTP modulate exocytosis from maize root cap protoplasts[J].The plant cell，1998，10（8）：1267-1276.

[3]張娜，尚忠林.植物细胞中的膜联蛋白（annexin）[J].植物生理学通讯，2010，46（3）：277-283.

[4]钱学磊，韩志颖，刘瑞齐，等.膜联蛋白：植物生长过程中的多功能复合物[J].广西植物，2013，33（5）：703-709.

[5]褚翠萍，任秋萍，孔兰静，等.拟南芥膜联蛋白2的亚细胞定位研究[J].中国细胞生物学学报，2017，39（7）：873-880.

[6]HUH S M，NOH E K，KIM H G，et al.Arabidopsis annexins AnnAt1 and AnnAt4 interact with each other and regulate drought and salt stress responses[J].Plant and cell physiology，2010，51（9）：1499-1514.