志贺菌ipaH基因PCR检测方法的建立及应用

文英 何永彩

摘要 为了掌握青海省4种食源性动物体内志贺菌的分布情况，针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H基因（invasive plasmid，ipaH）设计1对特异性引物，建立志贺菌的PCR检测方法，优化反应体系，检测该方法的敏感性和特异性，并将该方法应用于临床样本检测。结果表明，建立的PCR方法能特异性扩增志贺菌ipaH基因，而沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌等均未扩增出条带;最低检测限值为1.8 pg/μL。在臨床样本检测中，100株疑似菌株的阳性率为62.00%，其中牦牛源75.00%（3/4），鸡源35.29%（12/34），羊源44.44%（8/18），猪源88.64%（39/44）;新鲜鸡粪和羊粪的阳性率分别为91.67%（11/12）和90.91%（10/11）。这说明试验所建立的PCR方法具有良好的敏感性和特异性，可应用于志贺菌的实验室诊断;4种动物体内均不同程度带菌，在临床诊断和治疗时不可忽视该菌的致病作用。

关键词 志贺菌;聚合酶链式反应（PCR）;ipaH基因

中图分类号 R378.2  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）21-0103-04

Abstract In order to grasp the distribution of 4 kinds of foodborne Shigella sp.in animals in Qinghai Province，a pair of specific primers were designed according to Shigella invasive plasmid antigen H gene（invasive plasmid，ipaH） to establish PCR detection  method for Shigella sp..The reaction system was optimized，and the sensitivity and specificity of the method were detected.And this method was applied to detect the clinical samples.The results showed that the PCR method established by the experiment could specifically amplify the ipaH gene of Shigella sp.，but Salmonella sp.，Escherichia coli，Staphylococcus sp.，Bacillus subtilis，Proteus vulgaris，etc.did not amplify the specific band.The minimum detection limit was 1.8 pg/μL.Among the detected clinical samples，the positive rate of 100 suspected strains was 62.00%.And the positive rate of yakborne，chickenborne，sheepborne，pigborne Shigella sp.were 75.00%（3/4），  35.29%（12/34）， 44.44%（8/18） and 88.64%（39/44） respectively.The positive rates of fresh chicken manure and sheep manure were 91.67%（11/12） and 90.91%（10/11），respectively.The results showed that PCR method established by the experiment had good sensitivity and specificity，and the method could be applied in the laboratory diagnosis of Shigella sp..The four kinds of animals carried pathogen in different degrees，so the pathogenic role of Shigella sp.could not be ignored in clinical diagnosis and treatment.

Key words Shigella sp.;Polymerase chain reaction（PCR）;ipaH gene

基金项目 青海省农业农村厅项目（NMSY-2017-03）。

作者简介 文英（1974—），女，青海西宁人，副教授，硕士，从事预防兽医学研究。

收稿日期 2020-03-12

志贺菌为革兰阴性兼性厌氧菌，在自然界中分布广泛，是一类具有高度传染性和危害严重的肠道致病菌。志贺菌属（Shigella）是从多个独立的大肠杆菌（Escherichia coli）起源并经过趋同进化而形成的，可分为4 个种群[1]。国内外大量研究表明，志贺菌不仅感染人类，而且也会感染多种动物，包括鸡、牛、猪、兔、犬、狐狸和猴等多种动物，以腹泻和肠道病变为主要症状，尤其是幼龄动物的发病率和死亡率均很高。该病不仅严重危害了动物健康，而且给畜牧养殖业造成了巨大的经济损失[1-9]。

为摸清青海省4种食源性动物体内志贺菌的分布情况，根据GenBank数据库己发表的志贺菌属侵袭性质粒抗原H（invasive plasmid，ipaH）编码基因序列，设计1对特异性引物，建立PCR检测方法，并对不同动物源样本进行志贺菌的PCR检测，以期丰富青海地区志贺菌流行病学资料，也可为相关疾病的防治提供一定的理论依据。

不高，原因与粪便中其他菌群占优势，而目的菌群处于劣势，在菌株分离纯化的过程中没有被分离出来;志贺菌不同种间及同种不同菌株间生化特性有差异，常规分离鉴定易造成丟菌[15]，

且样品长时间冻存也会导致分离率的下降有关，因此该试验避开了常规分离鉴定的不足，仅收集在SS培养基上符合志贺菌菌落形态的菌株，直接用PCR方法进行检测，一定程度上提高了检出率，省时省力，并可为后续的分离鉴定工作带来方便。杨小蓉等[16]报道，当人粪便样本中人工接种菌量在104 CFU/mL以上时，不需要增菌，可直接从粪便样本中检出志贺菌。该试验采集动物新鲜粪便后直接提取DNA进行了PCR检测，结果阳性检出率（鸡源90.91%、羊源91.67%）很高，说明建立的PCR方法在动物临床样本中志贺菌的快速检测方面具有一定的应用前景，可为预防和控制由志贺菌感染疾病的流行提供技术手段。

检测结果也显示，在4种食品动物体内均不同程度携带志贺菌，虽然大多数动物临床上并没有腹泻症状，但还可检测出志贺菌，提示在不同种动物腹泻病和非腹泻病的临床诊断和治疗时不可忽视该菌的致病作用。鉴于志贺菌对公共健康的严重威胁，加强食源性动物健康带菌的监测及规范屠宰加工、运输、储存等环节的操作也十分重要。

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