矿区排土场复垦区玉米根际土壤真菌遗传多样性研究

刘宝勇 王丽莎 常敬华

摘要 [目的]研究矿区排土场复垦区和普通种植区土壤真菌多样性的差异。[方法]以阜新海州露天矿排土场复垦区玉米田土壤（K1区）、阜新市太平区下洼子村玉米田土壤（F1区）为研究对象，分析土壤的理化性质并利用基因组测序分析复垦区和对照区真菌多样性的差异。在此基础上，对复垦区和对照区样本中的真菌进行分离、纯化和分子鉴定，并分析可培养真菌的多样性。[结果]K1区和F1区土壤有效磷、速效钾、pH呈显著性差异，碱解氮和有机质呈非显著性差异;K1区的物种丰富度和均匀度均低于F1区，K1区鉴定出19个真菌属，而F1区共鉴定出52个真菌属，真菌的预测功能K1区比F1区少11种;K1区分离鉴定的真菌以青霉属（Penicillium sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）真菌为主，F1区分离鉴定的真菌以青霉属（Penicillium sp.）和木霉属（Trichoderma sp.）真菌为主。[结论]该研究为矿区生态修复、土壤改良提供理论依据和实践指导。

关键词 排土场复垦区;理化性质;真菌多样性;土壤改良

中图分类号 S154.3  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）21-0063-07

Abstract [Objective]To study the differences in soil fungal diversity in the mining areas wasteland reclamation area and ordinary planting area.[Method]Taking the cornfield soil （K1 area） in the reclamation area of Fuxin Haizhou openpit mine dumping field and the cornfield soil （F1 area） in Xiawazi Village，Taiping District，Fuxin City as the research objects，the physical and chemical properties of the soil were analyzed and the differences in fungal diversity in the reclamation and control areas were analyzed using genomic sequencing.Based on this，the fungi in the samples from the reclamation area and the control area were isolated，purified and molecularly identified and the diversity of culturable fungi was analyzed.[Result]The soil available phosphorus，available potassium and pH in the K1 and F1 areas showed significant differences，while the alkaline hydrolysis nitrogen and organic matter showed nonsignificant differences;the species richness and uniformity in K1 area were lower than those in F1 area.19 fungal genera were identified in K1 area，and 52 fungal genera were identified in F1 area.The predictive function of fungi in K1 area was 11 less than that in F1 area.Penicillium sp.and Fusarium sp.were the main fungi isolated and identified in K1 area，while Penicillium sp.and Trichoderma sp.were the main fungi isolated and identified in F1 area.[Conclusion]The study provides theoretical basis and practical guidance for ecological restoration and soil improvement in mining areas.

Key words Reclaimed area of mining dump;Physical and chemical properties;Fungal diversity;Soil improvement

基金項目

国家重点研发计划“重大自然灾害监测预警与防范”重点专项（2017YFC1503100）;科技部基础性工作专项重点项目（2013FY113400）。

作者简介 刘宝勇（1975—），男，辽宁葫芦岛人，副教授，博士，从事水土保持与矿山环境工程方面的教学与科学研究;王丽莎（1992—），女，辽宁丹东人，硕士研究生，研究方向：生态修复理论与技术。刘宝勇和王丽莎是共同第一作者。*通信作者，讲师，博士，从事真菌及真菌毒素控制技术研究。

收稿日期 2020-03-30;修回日期 2020-04-21

阜新露天矿是亚洲第一大露天煤矿，已因资源枯竭而关闭，但由于长期的开采造成生态环境破坏严重，矿区周边排土场土壤重金属含量升高，土壤养分流失，严重影响了排土场复垦区作物的生长[1-2]。对矿区排土场的生态重建工作一直是近年来国内众多专家和学者所关注和研究的热点之一。现代农业复垦是对排土场综合治理的重要手段之一。目前我国大部分农业复垦以传统土木工程复垦为主，但传统复垦方式使地表的土壤经过了机械压实，从而使土壤的孔隙度变小，团粒结构也受到了破坏，严重影响了植物根系在复垦地表土壤中的生长和延伸;利用生物复垦能高效恢复和提高土壤的质量和肥力、改善土壤团粒结构、促进土壤生物多样性，从而实现矿区排土场生态修复与土地可持续利用[3]。目前，微生物复垦技术已成为国内外研究的前沿和热点。微生物复垦技术与传统复垦方式相比具有技术费用低、复垦效果好、不会造成二次污染、操作简单等优点[4]。土壤真菌生物多样性是影响土壤品质和作物生长的重要因素。Bacon等[5]研究发现，感染了木霉菌（Trichoderma sp.）的植物和玉米种子被人食用后，可以有效减轻体内的镰刀菌毒素对人及其动物和牲畜的健康危害。曲霉属（Aspergillus sp.）和镰刀菌属（Fusarium sp.）真菌是玉米整个生命周期中最主要的致病菌，单格孢属（Ulocladium sp.）、链格孢属（Alternaria sp.）、木霉属（Trichoderma sp.）在我国玉米的生长初期较为多见[6]。枝顶孢属真菌（Acremonium zeae）可以在土壤中产生多种抗生素，对玉米病原菌串珠镰刀菌（Fusaraum verticillioides）和黄曲霉（Aspergillus flavus）的繁殖和生长起到抑制作用[7]。农业产中，有害植物真菌的大量积累会直接引起农作物产量的降低，有益植物真菌具有促进农作物植株生长、防治有害真菌及吸附土壤中重金属的作用[8]。

因此，对阜新矿区排土场复垦区和普通种植区玉米根际土壤中真菌遗传多样性进行分析，探讨相同的气候和不同土壤条件下真菌遗传多样性的关系和差异，并对2个类型土壤中的真菌进行分离、纯化和鉴定。研究结果有利于完善阜新矿区农业废弃地复垦的方法，有助于降低采矿过程带来的环境微生物污染和促进矿区土地微生物资源的合理利用，同时为同类型的矿区复垦区的土壤改良与治理提供参考，也为阜新矿区农业废弃地土壤生态环境的恢复与治理的研究提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 研究区概况 阜新市海州露天矿排土场复垦区地处辽宁省西北部低山丘陵区（121°40′12″E，41°57′36″N），总面积约为 13 km2，排土场区域呈阶梯状，沟壑纵横，陡坎坡平均坡度45°，盘面海拔平均为270 m，相对高差为3～60 m，最高处接近325 m，最低处不低于240 m，年均气温6.5～7.5 ℃，年均降水量420～540 mm，年均无霜期154 d，≥0 ℃活动积温3 647 ℃·d，≥10 ℃活动积温3 377 ℃·d。复垦区种植的玉米植株矮化，不结穗或畸形穗，几乎颗粒无收。

阜新市太平区下洼子村距海州露天矿排土场复垦区5 km，与露天矿排土场复垦区气候相同，玉米长势良好，籽粒饱满。

1.2 土壤样品采集与分析

于2018年8月分别对阜新海州露天矿排土场复垦区（K1区）和太平区下洼子村对照区（F1区）的玉米种植地的土壤多点取样。K1区和F1区分别设计5个采样点，每个采样点在10 m×10 m的范围内按对角线法取5个子样品（2 cm宽、5 cm深的土壤），混合为1个样品，土壤样本用冰盒保鲜带回。带回的样品过 1 mm 筛，一部分置于-80 ℃ 冰箱保存备用，一部分放于4 ℃冰箱中保存以便近期试验使用，其余样品自然风干，用于土壤理化性状分析。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤性质测定方法。K1区和F1区的土壤pH采用pH计法测定（LY/T 1239—1999）;碱解氮采用碱解扩散法测定;速效钾采用酸溶法测定;K1区酸性土壤有效磷采用氟化铵-盐酸浸提法测定，F1区的中性土壤有效磷采用碳酸氢钠浸提法测定（LY/T 1228—2015）;有机质采用容量分析法测定（LY/T 1237—1999）。

1.3.2 土壤真菌DNA提取及高通量测序。

采用SDS方法对土壤样本的基因组DNA进行提取并检测纯度和浓度，随后对目标片段进行PCR扩增及PCR产物回收纯化，之后使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建及荧光定量，由北京诺禾致源生物信息技术有限公司利用Illumina NovaSeq 测序平台对該文库进行双末端测序（Paired_End）分析。PCR扩增所用的引物为ITS5-1737F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS2-2043R：5′-CAACTCTTAGCGGTGGAT-3′。

1.3.3 土壤真菌的分离、纯化与分子鉴定。

采用稀释平板法对土壤真菌进行培养，所用培养基为添加链霉素的PDA培养基，利用无菌接种环挑取菌落边缘菌丝接种于新的平板中进行分离，培养3～5代，确保获得纯化菌株。

将纯化菌株接种于PDA平板上，28 ℃避光培养5～7 d。挑取菌丝体置于无菌研钵，液氮研磨。参照真菌基因组DNA小量提取试剂盒步骤进行操作，得到提取出的DNA溶液，-20 ℃保存备用。PCR扩增引物为ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGC）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）;PCR扩增反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，72 ℃最后延伸7 min。由青岛派森诺生物科技有限公司利用 Illumina Mi Seq 测序平台进行双端测序分析。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010对土壤理化指标进行数据处理和显著性差异分析。

测序数据分析首先对原始数据（Raw reads）进行拼接、过滤，得到Clean Tags，Clean Tags经过嵌合体的去除得到有效数据（Effective Tags），然后利用Uparse软件对有效数据进行聚类，默认以97%的一致性（identity）将序列聚类成为OTUs（operational taxonomic units），同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA132的SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1.0），获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。使用MUSCLE软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。

使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods_coverage、PD_whole_tree 指数，使用R软件（Version 2.15.3）绘制稀释曲线、等级聚类曲线，并使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析。

2 结果与分析

2.1 土壤理化分析

土壤的理化性质是影响微生物多样性和作物生长的重要因素。因此，分别对复垦区（K1区）和对照区（F1区）的5个土壤样品进行理化指标分析，结果见表1。从表1可以看出，K1区和F1区的碱解氮和有机质差异不显著，F1区的有效磷显著高于K1区，速效钾远低于K1区，且K1区土壤呈酸性，pH为5.75±0.14。研究认为，酸性土壤严重影响作物对土壤营养的吸收，其中碱解氮、速效钾在pH为6～8时有效性最高，有效磷在土壤pH为5.5～7.5时有效性最大，玉米生长最适的土壤pH为6.0～7.5[9]。因此，复垦区土壤pH偏低可能是影响微生物多样性和玉米生长状况及产量的重要因素。

2.2 土壤真菌遗传多样性分析

2.2.1 土壤真菌α多样性指数和物种多样性曲线。

对样本在97%一致性阈值下的α多样性指数（Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Goods_coverage、PD_whole_tree）进行统计，见表2。从表2可以看出，F1区土壤样品中真菌群落的α多样性指数Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD_whole_tree均显著高于K1区。

从样本中随机抽取一定測序量的数据，统计它们所代表物种数目（即OTUs数目），以抽取的测序数据量与对应的物种数来构建稀释曲线，见图1。K1区样本的真菌物种稀释曲线OUT数量在100～200逐渐趋向平坦，F1区样本的真菌物种稀释曲线OUT数量在500以上逐渐趋向平坦，说明两区测序样本数量合理并且数量充足，测序数量逐渐趋于饱和，且F1区真菌物种数量比K1区更丰富。将样本中OTUs的排序编号和OTUs中的相对丰度绘制成Rank Abundance曲线，见图2。K1区样本的真菌等级聚类曲线的跨度较小，总OTUs数量接近200;F1区样本的真菌等级聚类曲线的跨度较大，总OTUs数量在500～600，说明F1区的物种丰富度和均匀度均高于K1区。

2.2.2 真菌群落共有及特有OTUs分析。

将稀有的、丰度值低于全体样本总测序量1/100 000（0.001%）的OTU去除，在全部样本中共检测出OTU的数量为602个，把去除稀有OTU丰度的矩阵用于后续研究。根据聚类得到OTUs结果，分析不同样本（组）之间共有、特有的OTUs，绘制成韦恩（Venn）图（图3）。K1区与F1区经研究分别检测到185和554个OTU，其中共有OUT数为137个，K1区与F1区特有的OTU数分别为48和417个。

2.2.3 真菌物种门水平相对丰度分析。

根据物种注释结果，选取每个样本或分组在各分类水平（Phylum、Class、Order、Family、Genus）上最大丰度排名在前的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各样本在不同分类水平上相对丰度较高的物种及其比例。以门水平物种相对丰度柱形图为例展示如下（图4），其中F1区除未知菌门（47.6%）外，依次为子囊菌门（Ascomycota）38.5%、被孢菌门（Mortierellomycota）6.8%、担子菌门（Basidomycota）5.9%、球囊菌门（Glomeromycota）0.7%、壶菌门（Chytridiomycota）0.3%、被孢霉门（Mucoromycota）0.1%、捕虫霉门（Zoopagomycota）0.1%;K1区以担子菌门（Basidomycota）为主（72.2%），其次为未知菌门22.8%、子囊菌门（Ascomycota）4.1%、被孢菌门（Mortierellomycota）0.5%、壶菌门（Chytridiomycota）0.3%、捕虫霉门（Zoopagomycota）0.1%。 K1区与F1区相比，缺少了球囊菌门和被孢霉门。

2.2.4 真菌物种属水平丰富度分析。

为了进一步研究属水平物种的系统进化关系，通过多序列比对得到top100属的代表序列的系统发生关系（图5）。其中，K1区鉴定出19个属，除未知种属24.2%外，主要为粪伞科（Bolbitiaceae）未知属72.0%、煤炱目（Capnodiales）未知属0.8%、毛球壳科（Lasiosphaeriaceae）Echria sp.属0.7%、毛壳菌属（Chaetomium sp.）0.5%、镰刀菌属（Fusarium sp.）0.4%、青霉属（Penicillium sp.）0.4%、被孢霉科（Mortierellaceae）未知属0.4%、赤霉属（Gibberella sp.）0.3%、Rhizophlyctis sp.属0.3%;而F1区共鉴定出52个属，除未知菌属61.8%外，主要为赤霉属（Gibberella sp.）8.0%、绿僵菌属（Metarhizium sp.）6.2%、镰刀菌属（Fusarium sp.）5.5%、青霉属（Penicillium sp.）4.7%、被孢霉科（Mortierellaceae）未知属3.9%、毛壳菌属（Chaetomium sp.）3.1%、被孢霉属（Mortierella sp.）2.8%、格孢菌目（Pleosporales）未知属2.7%、Solicoccozyma属1.3%。其中，煤炱目（Capnodiales）未知属、毛球壳科（Lasiosphaeriaceae）Echria sp.属为K1区特有菌属，F1区除上述主要菌属外，另外还包括属于丛枝菌根的无梗囊霉属（Acaulospora sp.）0.7%和木霉属（Trichoderma sp.）真菌0.6%等益生菌。从以上结果可以看出，K1区和F1区群落在属水平上差异显著。

2.2.5 土壤真菌功能预测。

利用FunGuild真菌环境功能数据库，基于扩增子分析得到的物种信息，分析K1区和F1区真菌物种在环境中的生态功能，见图6。K1区依次主要为未定功能（97.6%）、未定义腐生物（1.1%）、粪腐-未定义腐生物-木腐生物（0.5%）、植物病原-土壤-木腐生物（0.4%）、植物病原（0.3%）、动物病原（0.1%）。F1区真菌依次主要为未定功能（64.1%）、未定义腐生物（11.7%）、植物病原（8.8%）、动物病原（6.4%）、植物-病原-土壤-木腐生物（5.4%）、粪腐-未定义腐生物-木腐生物（3.0%）、丛枝菌根（0.6%）。K1区真菌功能范围与F1区相比，K1区比F1区少11种功能，其中更是缺少了具有重要生态学功能的丛枝菌根。

2.3 土壤真菌的分离纯化和分子鉴定

2.3.1 土壤真菌的分离纯化。

在对土壤真菌多样性分析的基础上，对土壤中的真菌进行分离和纯化，进一步分析土壤中可培养菌种的多样性。K1区分离纯化出真菌菌株97株，F1区分离纯化出真菌菌株124株。分离所得的部分不同形态的真菌如图7所示。

2.3.2 DNA提取、测序。

对分离的土壤真菌进行DNA提取，部分土壤真菌rDNA ITS序列电泳图见图8。取各个菌种纯化后的PCR产物进行DNA测序。用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物種信息。其中，K1区测序成功的菌种共78株，F1区测序成功的菌株98株，部分菌种序列比对结果如表3所示。

K1区测序成功菌株分属6个种属，分别为青霉属（Penicillium sp.）真菌32株（42%），依次为草酸青霉（P.oxalicum）9株、微紫青霉（P.janthinellum）7株、波罗尼卡青霉（P.polonicum）5株、匍匐茎青霉（P.stoloniferum）4株、黄连青霉（P.chrysogenum）3株、拜莱青霉（P.bilaiae）2株、鲁本斯青霉菌（P.rubens）1株、橘灰青霉（P.aurantiocandidum）1株;镰刀菌属（Fusarium sp.）真菌22株（28%），分别为三线镰刀菌（F.tricinctum）5株、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）4株、串珠镰刀菌（F.verticillioides/G.moniliformis）13株;链格孢霉（Alternaria sp.）链格孢菌（A.alternata）真菌8株（10%）;曲霉属（Aspergillus sp.）菌核曲霉（A.sclerotioniger）真菌8株（10%）;毛霉菌属（Mucor sp.）真菌4株（5%），分别为总状毛霉（M.racemosus）2株、脆弱毛霉（M.fragilis）2株;木霉菌属（Trichoderma sp.）真菌4株（5%），分别为棘孢木霉（T.asperellum）2株、拟康宁木霉（T.koningiopsis）1株、哈茨木霉（T.harzianum）1株。F1区测序成功的菌株分属6个种属，依次为青霉菌属（Penicillium sp.）真菌56株（57%），分别为草酸青霉（P.oxalicum）34株、黄连青霉（P.chrysogenum）12株、卧青霉（P.decumbens）5株、二毒霉青霉（P.dipodomyicola）5株;哈茨木霉（T.harzianum）真菌28株（29%）;镰刀菌属（Fusarium sp.）藤仓镰刀菌（F.fujikuroi）真菌5株（5%）;枝孢菌属（Cladosporium sp.）真菌4株（4%），分别为C.Perangustum 2株、枝状枝孢菌属（C.cladosporioides）2株;曲霉属（Aspergillus sp.）霉白曲霉属（A.niveus）真菌2株（2%）;链格孢霉属（Alternaria sp.）链格孢菌（A.alternata）真菌2株（2%）;毛孢子菌属（Trichosporon sp.）阿萨希毛孢子菌属（T.asahii）真菌1株（1%）。从测序结果来看，K1区和F1区分离的菌株在种类和数量上存在一定的差别。

3 讨论

3.1 土壤理化性质对真菌多样性的影响

土壤真菌群落是

有机物质分解和提高土壤生物质含量的主要来源和组成部分[10]，是土壤健康的重要生物学指标。同时，土壤中有机微

生物真菌群落的多样性又受到了土壤有机质、pH、C、N、P及养分有效性等土壤环境因素的直接影响[11]。该研究中发现，虽然样品采集地具有相同的自然气候和土壤条件，但复垦区的土壤受阜新排土场的影响，其土壤速效钾、有效磷、pH与对照区具有显著的差别，使其真菌的组成、数量、群落生态结构和功能也与对照区相差较大。该研究中对土壤真菌多样性的研究及对真菌的分离纯化同样发现，复垦区土壤中的有益菌种类和数量均远低于对照区，而土壤中致病菌的数量和比例却远高于对照区。因此，研究认为复垦区土壤pH偏低等环境因素是造成土壤有益微生物真菌数量减少，有机质分解及N、P、K、S等多种营养元素的生态循环能力降低，植物有害真菌滋生的重要原因，从而造成了复垦区玉米植株矮化和不结穗。因此，阜新矿区复垦区的土壤改良和生态恢复初期，还是应该充分结合传统改良和其他化学改良的方法，如适当增施农家肥、种植耐酸作物（主要如豆类、荞麦等）以及适当增加喷施石灰调节土壤的耐酸性，从而有利于改善土壤的通透性，促进微生物的多样性。

此外，重金属的污染与土壤真菌的多样性密切相关，土壤中的重金属积累到一定程度，会严重影响微生物的种类和数量，进而影响土壤的呼吸作用[12]。但某些微生物在重金属污染的土壤中能够生长且对重金属具有一定的解毒作用[13]。煤矿的开采，使得矿区及周边地区土壤重金属污染普遍较为严重[14-16]，该研究从K1区分离的真菌也验证了这一点。K1区分离出的紫微青霉、草酸青霉、拜莱青霉以及链格孢霉等都是具有土壤重金属吸附作用的典型土壤微生物[17-18]。

3.2 复垦区与对照区真菌多样性差异

从复垦区与对照区土壤真菌α多样性指数和土壤真菌物种均匀度多样性指数的曲线可以看出，F1区的土壤真菌物种丰富度和均匀度均明显高于K1区。从真菌物种门水平和属水平相对丰度分析来看，在门水平上，F1区真菌门数比K1区多2个门。在属水平上，F1区比K1区多32个属，F1区属的分布比例相对均匀，而K1区则严重不平衡。其中K1区优势菌为粪伞科未知属72.0%，除去未知种属24.2%，其余种属比例均小于1.0%。同时，K1区缺少了丛枝菌根的无梗囊霉属和木霉属等益生菌属。从真菌的分离情况看，F1区真菌以青霉属和木霉属真菌为优势菌，K1区以青霉属和镰刀菌属真菌为优势菌，大多数木霉菌和青霉菌为作物益生菌，而镰刀菌是重要的致病菌。因此，K1区真菌种类少和比例的不平衡严重影响土壤性能和作物的生长，在利用真菌对土壤进行改良和生态修复时应关注增加真菌多样性的方法和益生菌的利用。