椰心叶甲、椰子织蛾肠道菌群多样性分析

李紫成，吕宝乾，卢 辉，唐继洪，何 杏，苏 豪

1中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室，海南 海口 571101；2浙江大学昆虫科学研究所，浙江省作物病虫生物学重点实验室，农业部作物病虫分子生物学重点实验室，水稻生物学国家重点实验室，浙江 杭州 310058

椰心叶甲BrontispalongissimaGestro是我国一种重要的危险性外来有害生物，原产于印度尼西亚，2002年入侵中国海南并暴发成灾，严重影响了棕榈植物种植业及相关产业(吕宝乾等，2005)。椰心叶甲危害椰树CocosnuciferaL.等棕榈植物的叶片，对未展开叶片危害尤其严重。同时，椰心叶甲具有繁殖速度快、破坏性强和防治难度大等特点。

椰子织蛾OpisinaarenosellaWalker是棕榈科植物上重要的害虫(李后魂等，2014)。雌蛾在椰子叶背面产下卵块，幼虫取食老叶表皮及叶肉，并在体外构造出丝和粪便的甬道，用以躲避天敌及不良环境等(Howardetal.,2001)。椰子织蛾原产于印度、斯里兰卡(Rao,1922)，现已扩散蔓延到泰国和马来西亚等国，2013年该害虫入侵我国海南、广西等地，在海南省风险值(R)为2.30，属高度危险有害生物(阎伟等，2013)。

与椰子织蛾、椰心叶甲外部生态、生物学研究相比，两者肠道内容物差异很少被研究。而肠道内容物对昆虫的生理生化行为具有多种影响，如肠道微生物能够调节寄主的免疫、发育，改变其食性等(相辉和黄勇平，2008; Ayakoetal.,2015)。同时,椰子织蛾、椰心叶甲相似的生态位与寄主范围，可能导致两者肠道内容物具有一定的相似性，使得同时入侵会加重危害程度。本文通过对椰子织蛾、椰心叶甲肠道样本进行菌群多样性分析以及肠道代谢通路功能预测，以求获得两者在肠道微生物、代谢通路之间的异同，探讨其对两者生态位分化、入侵机制的影响。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

在人工气候箱(A1000, Conviron, Manitoba, Canada)中以恒温(28±1.0)℃、RH 70%～80%、光周期L∶D=12∶12的条件，在养虫盒(25 cm×14 cm×7 cm，盒盖封有48 μm纱网)中分别饲养中国海南省儋州市采集到的椰心叶甲、椰子织蛾。

1.2 样品处理

将饥饿处理24 h后的3龄椰心叶甲置于冰上3～5 min，待其昏迷。使用70%酒精擦拭昆虫表面30 s，0.25%次氯酸钠浸泡1 min，再用无菌水漂洗3次去除外部污染物。在无菌环境下，使用灭菌后的细尖钳将昆虫腹部切开，取出整个肠道，立即用0.9%的无菌NaCl溶液冲洗2次，然后将内容物、中肠和后肠慢慢分离并置于不同的微量离心管(1.5 mL)中。每20头昆虫作为一个样本，实验重复5次，记为1号样本。5龄椰子织蛾进行相同处理，记为2号样本，实验重复5次。

1.3 主要仪器

超微量分光光度计NanoDrop2000(Thermo Scientific, USA)，PCR仪GeneAmp®9700型(ABI, USA)，Illumina MiSeq 平台(Illumina, San Diego, USA)。

1.4 椰心叶甲、椰子织蛾肠道分析

根据E.Z.N.A.®soil试剂盒说明书进行每个样本总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop 2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用通用引物对可变区进行PCR扩增，使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。以QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台将纯化后的扩增片段构建PE 2*300的文库。原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接。使用UPARSE软件(version 7.1 http:∥drive5.com/uparse/)根据97%的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier(http:∥rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对KEGG数据库，设置比对阈值为70%。肠道代谢通路丰度使用SAS OnDemand进行单因素分析。

2 结果与分析

2.1 椰心叶甲、椰子织蛾肠道微生物丰度差异

椰心叶甲、椰子织蛾肠道微生物相似度较大，其中,分类水平总丰度前10的物质分别为蓝菌门Cyanobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、Saccharibacteria、疣微菌门Verrucomicrobia、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、Chlorofiexi、酸杆菌门Acidobacteria(图1)，其中,酸杆菌门、Saccharibacteria、拟杆菌门、放线菌门、蓝菌门等在2种昆虫肠道样本中存在较大丰度差异。

图1 椰心叶甲与椰子织蛾菌落热图

2.2 椰心叶甲、椰子织蛾肠道微生物组间丰度差异显著性检验

经Wilcox秩和检验，椰心叶甲、椰子织蛾肠道内部分丰度前10的微生物丰度在两者中存在显著性差异(图2)。椰心叶甲肠道中的变形菌门(P=0.012)、Saccharibacteria(P=0.039)等群落丰度显著高于椰子织蛾；而椰子织蛾肠道中的蓝菌门(P=0.012)、放线菌门(P=0.022)、酸杆菌门(P=0.012)、疣微菌门(P=0.034)等群落丰度显著高于椰心叶甲。

图2 椰心叶甲与椰子织蛾菌门Wilcox秩和检验柱状图

2.3 椰心叶甲、椰子织蛾肠道KEGG代谢通路丰度差异分析

对椰心叶甲、椰子织蛾肠道进行分析，并结合KEGG数据库，可得出两者肠道代谢通路的差异，椰心叶甲的膦酸酯和亚膦酸盐代谢(F(1,8)=15.66,P<0.05)、N-聚糖合成(F(1,8)=7.58,P<0.05)等肠道代谢通路显著强于椰子织蛾，而椰子织蛾的酮体的合成和降解(F(1,8)=8.09,P<0.05)、维生素B6代谢(F(1,8)=8.22,P<0.05)、核黄素代谢(F(1,8)=6.10,P<0.05)、黄酮和黄酮醇生物合成(F(1,8)=8.48,P<0.05)等显著强于椰心叶甲(表1)。

表1 椰心叶甲、椰子织蛾KEGG肠道代谢通路丰度差异

3 讨论

昆虫肠道中栖息着大量与其存在共生关系的微生物(郭军等，2015)，这些微生物与昆虫的发育、进化等存在密切关系(姚明燕等，2017；魏晓莹等，2019)。昆虫体内的肠道共生菌具有提供消化酶、化学物质，改变昆虫摄取营养方式以及效率等重要功能(Akman & Douglas,2009; Mattéottietal.,2012)。通过16S rRNA菌群预测等发现，危害棕榈科植物的入侵害虫椰心叶甲、椰子织蛾在肠道菌群、肠道代谢通路等具有一定相似度与关联性。

椰子织蛾肠道中的蓝菌门、放线菌门、酸杆菌门、疣微菌门等微生物丰度显著高于椰心叶甲。其中放线菌门由于能产生多种抗生素，而被运用于农业、医药业(阮继生等，1990; Omura,1999)；疣微菌在实验室中难以培养，现仅发现具有固氮等少数作用，但其在系统发育的独特性已被证实(Dunfieldetal., 2007; John & John,2012)；对于酸杆菌门，前人发现酸杆菌门在土壤中具有分解植物残株中纤维素的功能(Timofeyetal.,2012)。椰子织蛾肠道中显著较高的酸杆菌门细菌丰度可能导致其在自然界中能够适应纤维素含量较高的老叶，而椰心叶甲肠道内较低的酸杆菌门微生物丰度使其在自然界中偏好取食纤维素含量较低的心叶(Cock & Pacr,1987; Voegele,1989)。二者肠道内菌群的差异性可能造成了两者不同的取食习惯，而不同的取食习惯可能诱导了两者生态位上不同的分化。

两者代谢通路方面也存在一定差异，椰子织蛾体内酮体的合成和降解、核黄素代谢、维生素B6代谢、黄酮和黄酮醇生物合成等通路丰度显著高于椰心叶甲，而椰心叶甲的膦酸酯和亚膦酸盐代谢、N-聚糖合成等肠道代谢通路显著强于椰子织蛾。酮体代谢在昆虫体内供能等方面具有重要的功能作用。椰子织蛾体内较高的酮体代谢功能，有利于其在入侵危害过程中传播扩散、加快族群建立，这与其成为重要入侵害虫息息相关(Hilletal.,1972)。核黄素则被证实对于呼吸链能量产生等存在关系(Bruinsetal.,1991)。椰子织蛾体内较强的核黄素代谢能力能够为其提供更高的呼吸供能。同时，在部分昆虫体内已经证实具有参与核黄素合成的共生菌(Minoruetal.,2015; Nakabachietal.,1999)。因此,椰子织蛾肠道内较强的核黄素代谢功能可能有其肠道共生菌的参与。而维生素B6对于昆虫体内多种游离氨基酸的积累具有促进作用，在泌绢昆虫体内，缺乏维生素B6能使丝腺发育停滞(张剑韵和黄龙全，2003)。椰子织蛾作为能够分泌丝质物的昆虫之一，其体内产生的丝质物对于其幼虫生存、蛹期羽化具有巨大作用。

本文通过16S rRNA菌群预测等分子生物学方法对椰子织蛾与椰心叶甲肠道共生菌、代谢通路等进行分析，初步探讨了两者肠道菌群、肠道代谢通路等差异对于两者生态位、取食习惯等可能存在的分化作用，但对于肠道共生菌中具体作用以及肠道代谢通路具体途径、相关酶仍需要进一步的探讨。今后将继续对椰子织蛾、椰心叶甲肠道代谢通路进行具体测定，同时部分肠道共生菌已经可以进行人工筛选以及培养(唐帅等，2016; Fangetal.,2013)，对于能够进行纤维素分解的共生菌也将继续分离，以求取得应用上的突破。