胆管癌miR-551b表达变化的临床意义及其靶基因生物信息学分析

刘学停，蔡 军，孙艳军，孙登群

胆管癌是恶性程度极高的一类消化系统恶性肿瘤，临床上所指的胆管癌是肝外胆管癌，包括肝门部胆管癌和远端胆管癌。因为疾病的早期诊断难度大、肿瘤的恶性程度高、局部解剖特点复杂，胆管癌的根治性切除率较低、预后较差，术后5年总体生存率不足5%[1,2]。目前关于胆管癌发病机制的认知不足，已有研究证实多种原癌基因、抑癌基因在胆管癌中异常表达[3-6]，但调控原癌基因、抑癌基因表达的机制仍有待探究。微小RNA(microRNA，miR)是具有广泛生物学功能的非编码小分子RNA，对多种原癌基因、抑癌基因的表达具有调控作用并在多种消化道恶性肿瘤的发生发展中起关键作用。胆管癌相关的细胞实验表明，miR-155b能够靶向原癌基因细胞周期素D1(cyclinD1)并抑制胆管癌细胞的生长，提示miR-155b可能参与胆管癌的发生发展[7]。为了明确miR-155b在胆管癌发生及病情转归中的作用，本研究探究了胆管癌中miR-551b表达变化的临床意义并采用生物信息学的方法分析了miR-551b的靶基因。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014-10至2018-10在我院行胆管癌根治术的78例患者作为胆管癌组，纳入标准：(1)经术后病理诊断为胆管癌；(2)临床和病理资料完整；(3)随访资料完整；(4)患者知情同意。排除标准：(1)术前接受过放化疗；(2)既往有其他恶性肿瘤病史。另取同期因胆管结石行Roux-en-Y胆肠吻合术的40例患者作为对照组，术中留取正常胆管组织。研究经医院伦理委员会批准。胆囊癌组中男42例，女36例，年龄39～72岁，平均(51.49±12.92)岁；对照组中男23例，女17例，年龄32～71岁，平均(48.95±13.12)岁。两组间一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 miR-551b表达的荧光定量PCR检测 取胆管癌组织和正常胆管组织，采用天根公司生产的试剂盒进行实验，按照miRNA提取分离试剂盒的说明书进行操作、分离组织中的miRNA，按照miRNA cDNA第一链合成试剂盒的说明书进行操作、将miRNA反转录为cDNA，按照miRNA荧光定量检测试剂盒的说明书配置PCR反应体系，按照95 ℃预变性3 min后95℃ 5 s、60 ℃ 15 s重复40个循环，软件生成循环曲线及循环阈值(cycle threshold，Ct)，根据Ct值计算miR-551b的表达量。

1.2.2 临床病理特征的收集 回顾胆囊癌患者的病史资料，收集以下临床病理特征的信息：性别、年龄、术前CEA含量、术前CA19-9含量、TNM分期、肿瘤分化程度、微血管侵犯情况。术前CEA≥5 ng/ml为含量升高、CA19-9≥37 U/ml为含量升高，TNM分期参照美国癌症联合委员会(AJCC)的标准进行判断，肿瘤分化、微血管侵犯参照术中所见及术后病理结果判断。

1.2.3 生存期的随访 采用回顾门诊复诊资料以及电话回访的方式进行生存期的随访，随访截止日期为2019-10，根据死亡时间计算患者的总生存期(overall survival，OS)。

1.2.4 miR-551b靶基因的生物信息学分析 在Targetscan网站中进行miR-551b靶基因的生物信息学分析，录入miR-551b后分析miR-551b靶向的基因及位点。

1.2.5 miR-551b靶基因的western blot检测 取胆管癌组织和正常胆管组织，加入RIPA裂解液后研磨组织，研磨液在4 ℃离心机中12 000 r/min,离心20 min，收集上清液并测定蛋白含量，取30 μg蛋白进行western blot检测。将蛋白样本加入聚丙烯酰胺凝胶中，电泳、电转NC膜后用5%脱脂牛奶室温封闭NC膜1 h，4 ℃孵育cyclinD1及β-actin的抗体过夜；次日，洗膜后室温孵育二抗1 h，最后在凝胶成像系统中显影得到蛋白条带，根据条带灰度值计算表达量。

2 结 果

2.1 胆管癌组织和正常胆管组织中miR-551b表达量的比较 正常胆管组织和胆管癌组织中miR-551b的表达量分别为(0.78±0.22)和(0.48±0.15)，后者表达明显减少，差异有统计学意义(t=9.115，P<0.05)。

2.2 不同临床病理特征胆管癌组织中miR-551b表达量的比较 不同性别、年龄患者胆囊癌组织中miR-551b表达量的比较，差异无统计学意义；术前血清CA19-9升高、CEA升高、TNM Ⅲ期、低未分化、微血管侵犯患者胆囊癌组织中miR-551b的表达量明显低于术前血清CA19-9正常、CEA正常，TNM Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、无微血管侵犯的患者，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.3 不同miR-551b表达患者总生存期的比较 与miR-551b高表达的胆管癌患者比较，miR-551b低表达的胆管癌患者的总生存期明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

表1 胆管癌患者临床、病理特征与癌组织中miR-551b的表达量分析

图1 胆管癌患者miR-551b表达状况总生存期比较

2.4 miR-551b靶向cyclinD1的生物信息学分析及临床样本验证 在Target scan网站进行生物信息学分析，miR-551b靶向cyclinD1基因mRNA 3’UTR的第1456-1462碱基、1479-1486碱基，见图2。进一步采用western blot检测cyclinD1的表达量，蛋白条带见图3，正常胆管组织和胆管癌组织中cyclinD1的表达量分别为(0.55±0.21)和(0.87±0.28),胆管癌组织中cyclinD1的表达水平明显高于正常胆管组织，差异有统计学意义(t=6.184、P<0.05)；胆管癌组织中cyclinD1的表达水平明显高于正常胆管组织，差异有统计学意义(P<0.05)且cyclinD1的表达与miR-551b 的表达具有负相关关系(P<0.05，图4)。

图2 miR-551b靶向cyclinD1的生物信息学分析

图3 胆管癌患者正常胆管组织和胆管癌组织中cyclinD1表达的western blot检测

图4 胆管癌患者癌组织中miR-551b与cyclinD1的相关性

2.5 胆管癌患者生存影响因素的Cox回归模型分析 以胆管癌患者的预后作为应变量，以性别、年龄、术前血清CA19-9及CEA、TNM分期、分化程度、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表达作为自变量，经Cox回归模型分析，术前CA19-9、TNM分期、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表达是预后的影响因素(P<0.05，表2)。

表2 胆管癌78例生存影响因素的Cox回归模型分析

3 讨 论

胆管癌的恶性程度高、早期诊断难度大，临床上尚缺乏十分有效的治疗手段，手术切除辅助以放化疗的治疗方式预后差、5年生存率低。胆管癌的发病机制仍未完全阐明，直接制约了靶向治疗药物的研发，因此，研究胆管癌的发病机制、寻找胆管癌发病过程中的关键调控基因是近些年相关领域的研究热点[8-10]，探明促进胆管癌发生发展的关键基因不仅能够为发病机制的研究提供理论支持，还有利于临床工作中早期筛查疾病、准确判断病情及预后。

miRs参与多种基因表达的调控，靶向抑癌基因的miR能够起到促癌作用，靶向原癌基因的miR能够起到抑癌作用。MiR-551b是具有抑癌作用的miR，在胃癌、结肠癌、宫颈上皮内瘤变中均呈低表达趋势[11-13]。Wang等[4]关于miR-551b与胆管癌关系的研究证实，胆管癌组织及胆管癌细胞中miR-551b的表达减少，过表达miR-551b能够抑制胆管癌细胞的增殖及细胞周期，同时也能抑制胆管癌移植瘤的生长。本实验对胆管癌组织中miR-551b表达的分析结果与Wang等[4]研究结果一致。

癌细胞过度增殖是胆管癌重要的病理特征，本实验进一步分析了miR-551b低表达与胆管癌临床病理特征的关系，术前血清CA19-9及CEA升高、TNM分期增加、分化程度降低、微血管侵犯与胆管癌中miR-551b表达减少有关。CA19-9及CEA是消化道恶性肿瘤常用的标志物，虽然特异性较弱，但术前血清CA19-9及CEA的升高能够在一定程度上反映肿瘤负荷的增加及病灶内癌细胞活跃的增殖；TNM分期增加、分化程度降低、微血管侵犯直接反映肿瘤病理特征恶化，提示癌细胞较强的恶性生物学行为。结合本研究的分析结果，胆管癌miR-551b的低表达与病理特征的恶化有关。

miR本身不直接参与细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为的调控，其生物学作用的实现依赖于靶基因表达的调控，与靶基因mRNA 3’UTR结合后能够使mRNA降解或阻碍mRNA反应，最终实现靶基因表达的负调控。Chang等[7]的细胞实验证实，miR-551b能够在胆管癌细胞中靶向抑制cyclinD1。本研究通过生物信息学分析验证了这一靶向调控作用并发现：miR-551b靶向cyclinD1基因mRNA 3’UTR的第1456-1462碱基、1479-1486碱基。CyclinD1是调控细胞周期的关键蛋白，能够加速细胞周期、促进细胞有丝分裂。国外Sittithumcharee等[14]及国内田立斌等[15]的研究均表明，cyclinD1的高表达参与胆管癌的发生发展。本研究的分析与前人的研究一致，即胆管癌中cyclinD1的表达量高于正常胆管组织。此外，本研究还证实了胆管癌中miR-551b与cyclinD1具有负相关关系，结合miR-551b靶向cyclinD1的生物信息学分析及他人的细胞实验结果提示，靶向抑制cyclinD1是miR-551b参与胆管癌发生发展的可能机制。

本实验还对胆管癌患者术后的生存情况进行了随访，经生存曲线分析可知：胆管癌中miR-551b低表达患者的总生存期较短，与miR-551b低表达和胆管癌病理特征恶化的分析结果吻合，进一步验证了miR-551b参与胆管癌发生发展的结论。此外，本研究还在COX回归模型中分析了胆管癌患者总生存期的影响因素，术前CA19-9、TNM分期、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表达被证实与胆管癌患者的远期生存相关，由此也进一步明确miR-551b低表达在胆管癌发生发展中的作用。

综上所述，胆管癌中miR-551b表达减少与病理特征恶化、总生存期缩短相关，靶向cyclinD1是miR-551b参与胆管癌发生发展的可能机制，今后miR-551b有望成为阐明胆管癌发病机制的候选基因，也可以将miR-551b作为靶点深入研究胆管癌的靶向治疗方法。