一氧化氮与肠道炎症关系的研究进展

龚震宇,刘顺财

在炎症的发生发展过程中，一氧化氮(nitric oxide ，NO)起到何种作用一直是生理学领域具有争议性的课题之一。相当多的研究已证实，NO具有潜在的抗炎作用；但其他相关研究也显示，NO也可能具有促炎作用，主要表现为促进炎性细胞增殖，以及促进组织损伤。目前，关于上述研究结果的具体原因和机制还无法定论，笔者认为如果能更深入地理解NO的生理化学作用和代谢机制，将会为解释NO的抗炎或促炎的本质原因勾勒出正确的蓝图。NO在发挥其生理化学作用时涵盖了较多的基本反应，这些反应过程十分复杂。相关领域内专家及学者通过对其直接效应与间接效应分别进行研究，以简化理解整个生理化学过程。当处在在生理状态下，并且NO的水平较低时，NO可以直接与生物分子发生反应，从而产生促炎或抗炎的效果，此即为NO的直接效应。反之，当NO水平较高，NO要先与氧气(或超氧化物)发生反应，最终产生氮氧化物，再由后者反应产生与生物分子之间发生作用，即间接反应。该种间接反应可能在急性炎症发生过程中起主导作用。采用此类分类方法具有较多的优势，并且综合考虑各种影响因素，如反应发生的时间和部位，产生的速率，和其他各种可能因素。

1 肠炎发生过程中NO的作用

已有较多的相关研究证实，在内脏缺血再灌注及其他急性肠道炎症发生过程中，NO是一种重要的保护剂。但其具体保护机制和过程如何，目前尚不明确，例如：当发生急性肠道炎症时，内源性NO浓度是否有变化？其变化情况如何？其中起作用的细胞分子机制又是什么？外源性NO是否也在其中发挥了某种作用？其效果又是怎样的？如果机体存在NOS缺失的情况，其后果又将如何？

1.1 NO与内皮细胞功能障碍之间的相互作用对急性肠道炎症的影响

相关研究已表明，缺血再灌注、软组织创伤和肠系膜缺血再灌注等各种急性应激状态都将影响内皮细胞的正常功能，导致出现内皮细胞功能障碍，主要表现为内源性NO(endogenous NO，EDNO)明显降低[1]。肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)是内皮细胞功能障碍的主要部位之一[1-2]，其发生往往见于以下两种情况，一是软组织创伤[3]；二是肠系膜缺血再灌注，包括内脏动脉闭塞和再灌注(SAO/R)等[4]。当内皮细胞功能出现障碍后，往往在5 min内就可以有上述两种情况的发生[3]，甚至会出现肠道缺血[4]。在这个过程中，EDNO的损失量随着时间的推移急剧上升，5 min时为40%～60%，到2 h时可高达75%～85%[5-6]。相关数据显示，EDNO损失的主要原因可能是：当处于缺氧或缺血状态下时，氧气再进入机体后，会导致超氧游离基快速释放，由此产生超氧自由基可以抑制NO的损失[7]；但目前其确切机制尚不清楚。根据最新的研究数据显示，当SMA处于闭塞和再灌注情况时，中性粒细胞可以促进EDNO损失[2]。

1.2 外源性NO在肠炎中的作用

1990年，Aoki等人[8]完成了对外源性NO在肠炎发生发展中作用的相关研究，这是有记录的最早的相关研究。该研究过程为：首先在生理盐水中溶解微量的NO气体，再将溶解有NO气体的生理盐水注射在血管内，以可以产生NO的酸性NaNO2溶液作为对照，探讨其对经受SAO/R后的猫动脉血压的影响。结果显示，上述经过处理后的生理盐水和对照组溶液能够稳定猫的动脉血压，使得猫的生存率明显提高。推测上述结果的出现与以下因素有关：NO能够显著降低溶酶体遭到破坏的可能性，抑制蛋白质的水解，此外还能够降低因胰腺缺血引起的心肌抑制因子形成。Fox-Robichaud等[9]以猫为实验模型，通过建立肠系膜缺血再灌注的猫模型，再对模型使用吸入性NO而进一步证实了上述结论。Fox-Robichaud等的结果显示，当肠道出现缺血再灌注损伤时，通过吸入NO后，白细胞趋化、吸附和浸润现象明显减少，但对于正常无损伤的生理肠道则未观察到此现象。上述研究结果表明，NO对于因缺血再灌注损伤引起的肠道炎症，主要发挥保护肠实质和血管细胞的作用，这种保护作用无论是无机NO气体还是其他有机NO(如C87-3754、亚硝基乙酰青霉胺[11]、硝普钠[12-13]等)都可以实现[10-13]。当肠系膜静脉在SAO/R后，其中的硝酸/硝酸盐含量下降，此时有机NO即发挥保护作用，同时在此种情况下，NO供体还具有降低血小板-白细胞聚集的作用[12]。

1.3 NOS缺失的影响

在炎症的发生过程中，如果出现以下两种情况，一是NO水平降低速度过快，二是急性炎症反应的降低是由NO的替代物通过保护肠道而实现的，此时必须要关注的重点之一是：当作用于NO及其衍生物的酶缺失或被阻断时，会有何种现象发生?

为弄清上述疑问，领域内学者进行了一系列相关研究。如Kubes等[14]通过相关研究首先证明，当NOS被阻断后，肠道会出现毒性反应。以老鼠为实验模型，Davenpeck等[15]详细阐述了NOS抑制与白细胞-血管上皮细胞之间作用始动过程的关系。他发现当NOS被抑制后，白细胞与血管上皮细胞之间的相互作用将会显著增强。同时，通过免疫组化实验，他发现由于肠系膜上皮细胞表面的P选择素上调，导致L-NAME诱导的白细胞出现了滚动[15]。还有研究使用了基因靶向小鼠，如Hickey等人[16]通过选择性敲除三种亚型的NOS小鼠，即敲除了上皮组织NOS(nitric oxide synthase，eNOS)，神经NOS(nNOS)和诱导NOS(iNOS)的小鼠，结果证明被敲除了iNOS的小鼠将发生内毒素血症，这是因为白细胞与内皮组织的相互作用得到了加强；而敲除了其他两种亚型的NOS小鼠，肠系膜外周静脉中的白细胞滚动和粘附能力显著提高，增加了4～7倍。这主要是由于凝血酶的刺激和P选择素的双重作用下，白细胞与血管上皮之间的相互作用强度会显著增加。

2 NO的抗肠炎机制

肠道微血管上皮的局部炎症可以被NO抑制，这一结论目前已得到证实。不过其具体机制尚不明确。目前认为，白细胞与血管上皮细胞之间相互作用诱发的炎症，可以被NO抑制，尤其是在肠炎早期。这可能主要通过两个方面起作用：抑制上皮细胞的通透性，以及抑制白细胞与血管上皮细胞的相互作用。其过程可能涉及以下两种信号通路：首先是超氧游离基与活化的NO之间发生相互作用。在血管上皮细胞与炎性诱导的白细胞发生作用的过程中，超氧游离基会对该过程造成一定影响，但受到超氧化物歧化酶的抑制作用，最终造成过氧化物失去活性或者作用效果[17]。最后的结果是，超氧游离基反而能够促进形成过氧化氢，后者又进一步诱导表达P选择素。其次，通过抑制蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的活性，NO发挥其抗炎作用[6]。主要表现为，在P选择素的表达和转录过程中，NO通过可溶性鸟苷酸环化酶的活化，刺激了IκB-α启动子，最终PKC的活性也被抑制，从而导致P选择素的表达和转录也受到抑制。

3 在炎症发生过程中NO的分子机制

研究显示，在炎症的发生过程中，NO含量将会显著升高，主要是与表达产生了iNOS有关。在正常生理条件下，NO会发挥其抗炎作用，但是当慢性炎症发生发展时，NO却发挥促进炎症发生发展的作用。目前领域内关于慢性炎症发生发展时，NO的促炎作用具体机制，尚无统一定论。有可能是因为NO过弱的抗炎作用被掩盖，也有可能是因为其他各种因素影响NO的抗炎效果。笔者推测，在此过程中NO发挥促炎作用，可能与其会NO2，N2O3，ONOO-等各种更高级形式氮氧化合物进行转化有关。据此，可以将iNOS作为一种标记物，以证实NO发挥促炎作用的相关机制。此外，在炎症发生过程中，不仅仅是NO会引起组织损伤以及功能丧失，氮氧化合物也是其中重要的物质之一。

3.1 NO介导的组织损伤生物标记物：诱生型一氧化氮合酶

已有研究显示，NO相关产物同时具备促炎和抗炎效果，且二者作用相当[18]。iNOS产生NO时，需要依赖细胞内的钙离子。但是，当iNOS表达完成后，其可以独立完成产生NO的过程；在某些条件下(如短期或急性实验模型)，iNOS因时间有限，无法完全表达。因此，只有cNOS发挥的功效可以作为证据。NO在不同时间段发挥不同的生物作用，并且这种作用往往是相反的，可以通过细菌内毒素(脂多糖，LPS)对肠道的损伤过程加以体现。例如，在对实验模型静脉给药3 h后，LPS会通过白细胞滚动、脉管系统等方式对肠道产生明显的损伤。给药3 h后，由于存在NOS的抑制物，导致肠道损伤进一步加重。但是，NO会在此过程中发挥其保护作用，减轻肠道损伤。这是因为同时存在NO的供体，从而缓解肠道损伤。当静脉给药6 h后，由于时间有限，静息的iNOS不能完全表达，最终导致LPS会继续发挥其对肠道的损伤作用[19]。反之，当给药时间在3 h内，静息的iNOS有时间充分表达，可以一定程度上抑制LPS对肠道的损伤作用。上述结果提示，在临床治疗过程中，必须要考虑时间因素的影响[18]。但仍然需要结合实际情况进行考量，例如，在对胃炎、炎症性肠病、关节炎等各种慢性炎症进行治疗时，联合采用NO产物的抑制剂比较有效[20-23]。而在治疗再灌注性损伤时，起病之时，采用NO供体往往最有效果[18]。其他观点还认为，NO受到不同因素的影响才发挥其毒性作用，包括iNOS的表达(NO发挥其毒性作用)，以及NO产物增加的不同阶段。

3.2 NO的氧化与氮氧化合物的产生

理论上讲，当NO和氧气聚集，并且达到一定条件都可以发生反应。亚硝酸盐是二者反应的终产物，NO2和N2O3则是其存在时间相对较短的中间产物。同时，有研究认为，当二者处在细胞膜疏水环境中时，反应速度将大大提高[24]。Grisham[25]通过相关实验证明，二者反应的终产物之一亚硝胺的合成过程，可以通过活化的中性粒细胞加快。不仅如此，而且iNOS的表达越强烈，该反应过程越快。但诸如维生素C、5-对氨基水杨酸(5-para-aminosalicylic acid，5-ASA)等一类抗氧化剂，在不直接与NO发生作用的前提下，反而会抑制亚硝胺的合成。Fiorucci等[26]证明，某些预防胃黏膜损伤的非甾体抗炎药(由NO所主导)，可以与硫醇类物质发生亚硝化反应，即表现出药物与半胱天冬酶(细胞凋亡蛋白酶)发生反应，并进一步引起肿瘤坏死因子α介导的细胞凋亡通路被抑制。

4 展望

当前可以明确的是，NO对局部组织发挥作用的形式受不同条件的影响。当NO由cNOS产生时发挥保护作用，然而，但当其由iNOS产生时，既可以起保护作用，也能够发挥毒性作用。以小鼠为实验模型的动物实验已经证明，在生理和病理环境下，NO发挥不同的生物学作用：当发生急性炎症时，细胞因子大量暴露，NO可发挥其保护作用，抑制细胞凋亡，类似于细胞凋亡抑制因子；但如果现实环境可以发生氧化还原反应，NO受到诱导后，其产物反而会引起组织损伤。例如，当NO是通过eNOS作用下产生时，可以发挥维持灌流作用，并且阻止血小板粘附、血栓形成和PMN的聚集，这些对于组织细胞十分有益，而诱导型NO的产物则具有相反的作用。

可以预见的是，在未来临床治疗过程中，可以采用某一类一氧化氮合酶的抑制物进行治疗。对于因NO引起的组织损伤的治疗，则考虑采用清除NO或者过氧硝酸盐的物质。不仅如此，在治疗休克或缺血再灌注损伤时，选择那些能够缓慢而长期释放少量NO的化合物；同样的，对于溃疡的预防以及减少因非甾体类抗炎药引起的胃肠副作用，可以选择NO释放类的药物与非甾体类抗炎药联合使用。