沙库巴曲缬沙坦钠对心力衰竭大鼠心肌内质网应激的影响

张志敏,马丽群,魏 星,李慧杰,路 军,王国位,周圣华(新疆军区总医院心内科,乌鲁木齐 830000;新疆军区总医院保健科;通信作者,E-mail:070907@qq.com)

心衰是各种心脏疾病的严重表现或晚期阶段,由左心室功能受损开始至心衰是一个进行性发展的必然过程,如何减缓心衰发展,延长患者寿命始终是心血管领域研究热点。沙库巴曲缬沙坦钠是一种治疗慢性心衰的新型复合药物,为血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂,对RASS系统及利钠肽降解有双重抑制作用,且两药结合对改善心衰有协同增效作用,明显降低心衰住院率[1,2];目前对沙库巴曲缬沙坦钠改善心衰的临床研究较多,但其对心肌细胞协同作用分子调控机制尚不可知。ERS是多种心血管危险因素损害心肌细胞的重要分子机制,心衰危险因素如糖尿病、高血压、高同型半胱氨酸血症等均可诱导心肌细胞ERS[3,4],ERS过度激活可诱导CHOP、caspase-12等促凋亡因子过表达,以调控细胞凋亡,促进心肌重构发生发展。然而,沙库巴曲缬沙坦钠是否通过抑制ERS保护心肌细胞目前尚不清楚。本研究通过使用沙库巴曲缬沙坦钠干预,观察其对心衰大鼠心肌细胞GRP78和CHOP蛋白表达的影响,同时观察大鼠心肌结构和功能的改变,以探讨沙库巴曲缬沙坦钠改善心衰进程的分子机制,为其防治提供新的理论依据。

1 材料及方法

1.1 实验动物及材料

成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠20只,6-8周龄,体质量180-200 g,由新疆医科大学实验动物中心提供。沙库巴曲缬沙坦钠(诺华制药),缬沙坦胶囊(诺华制药),兔抗大鼠GRP78抗体及兔抗大鼠CHOP抗体(美国Abcam公司),碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(美国Abcam公司),BNP及sST2 ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技公司),BX41型光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社);Lab Chart生物信号采集系统(美国Thermo公司);DP71型显微摄像系统(日本奥林巴斯株式会社);图像分析软件(美国Media Cybernetics公司);小动物超声仪(日本飞利浦公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及实验分组 将20只成年雄性SD大鼠禁食不禁水12 h,使用1%戊巴比妥钠按45 mg/kg麻醉,仰卧固定于鼠板上,沿腹中线逐层切开腹壁,暴露腹主动脉,于双侧肾动脉分支上小心剥离腹主动脉,将7号针头置于腹主动脉上,使用外科手术缝线将腹主动脉及7号针头共结扎,抽出针头;其中5只大鼠只剥离腹主动脉不结扎,逐层关闭腹腔,将术后未清醒大鼠置于保暖垫待苏醒,作为假手术组。所有纳入实验大鼠均给予普通大鼠颗粒饮料喂养,自由饮水。假手术组5只大鼠,使用生理盐水2 ml灌胃,2次/d;其余15只行TAC术大鼠随机分为三组:TAC组、缬沙坦组和沙库巴曲缬沙坦组,每组5只,实验共10周。TAC组使用生理盐水2 ml灌胃,2次/d;缬沙坦组使用缬沙坦钠以总量10 mg/kg溶于2 ml生理盐水中分2次/d灌胃;沙库巴曲组使用沙库巴曲缬沙坦钠以10 mg/kg缬沙坦量计算,溶于2 ml生理盐水中分2次/d灌胃。术后第10周末检测相关指标。

1.2.2 颈动脉插管法检测大鼠血压及左心室血流动力 各实验组大鼠检测前12 h禁食不禁水,使用1%戊巴比妥钠按45 mg/kg麻醉大鼠,沿颈部正中线切开皮肤,探查并分离右颈总动脉,使用血管钳夹闭近端颈总动脉并结扎远端。于血管壁上做“V”形小切口,将测压导管通过右颈总脉置于升主动脉,由多道生理记录仪检测血压、心率。将测压导管置于左心室,可见宽大均匀波型,待心室压力波稳定时,使用Lab Chart生物信号采集系统进行数据采集。测量指标包括平均左心室舒张末期压(LVEDP)、平均左心室收缩峰压(LVPP)、平均压下降最大速率(-dP/dtmax)和平均压力上升最大速率(+dP/dtmax)。

1.2.3 小动物超声检测大鼠心脏功能 大鼠实验前12 h禁食但不禁水,使用1%戊巴比妥钠按45 mg/kg麻醉大鼠,仰卧位将大鼠固定于超声检测板上,将大鼠右胸心前区毛发脱净,使用13 MHz M型超声探头连续测量5个心动周期。记录左心室收缩末期内径、左心室舒张末期内径、左心室收缩末期容积、左心室舒张末期容积,计算射血分数(EF)及左心室短轴率(FS)。

1.2.4 Masson染色大鼠心肌组织纤维化 术后第10周末将大鼠心肌组织取出置于4 ℃ 4 g/L多聚甲醛中固定24 h,使用酒精梯度脱水后石蜡包埋,连续切取厚约4 μm切片。经脱蜡后水化,使用苏木素染色,后置于丽春红酸性品红液中染色,1%磷铝酸染色,滴加苯胺蓝液后烘干,二甲苯透明树胶封片。光镜下观察心肌纤维胞质呈红色,心肌细胞胞核呈蓝色,胶原纤维呈蓝色。

1.2.5 ELISA检测大鼠心肌组织BNP及sST2水平 将大鼠心肌组织剪碎,加入0.5 ml组织裂解缓冲液,使用超声匀浆仪低温环境下均浆,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min,取上清液,按BNP及sST2 ELISA检测试剂盒说明书步骤进行检测,使用酶标仪检测吸光度,计算BNP及sST2水平。

1.2.6 Western blot检测大鼠心肌组织中GRP78及CHOP表达 将大鼠麻醉后处死,迅速取出大鼠心脏,于冰生理盐水冲洗并使用滤纸吸干,将心尖部组织剪成细小碎块,按比例加RAPA裂解液,置于冰上用超声匀浆机匀浆后静置30 min待其充分裂解,将超速离心机预温至4 ℃,以12 000 r/min转速离心20 min,取上清并测定蛋白浓度。将1/4体积loading buffer加入上清,100 ℃沸水中煮5 min,-80 ℃保存。取等量蛋白样品于100 g/L SDS-PAGE凝胶恒压电泳分离并转至PVDF膜上。使用封闭液封闭1 h,依次滴加1 ∶1 000兔抗大鼠GRP78、CHOP抗体,塑封后置于恒温4 ℃冰箱,振荡孵育12 h,TBST洗膜7 min×3次,1 ∶5 000 HRP-羊抗兔IgG,于室温振荡孵育2 h,洗膜后使用Bio-ray凝胶成像分析系统进行灰度扫描分析,计算A值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血压、心率及左心室血流动力学指标的变化

与假手术组相比,TAC组大鼠MAP值显著升高(P<0.01);与TAC组相比,缬沙坦组MAP明显降低(P<0.05),沙库巴曲缬沙坦组MAP显著降低(P<0.01)。与假手术组相比,TAC组大鼠HR明显升高(P<0.05);与TAC组相比,缬沙坦组及沙库巴曲缬沙坦组HR均明显降低(P<0.05)。与假手术组相比,TAC组大鼠LVPP和+dP/dtmax均显著降低(P<0.01),LVEDP和-dP/dtmax均显著升高(P<0.01);与TAC组相比,缬沙坦组及沙库巴曲缬沙坦组LVPP明显升高(P<0.05),缬沙坦组+dP/dtmax明显升高(P<0.05),沙库巴曲缬沙坦组+dP/dtmax显著升高(P<0.01),缬沙坦组LVEDP和-dP/dtmax明显降低(P<0.05),沙库巴曲缬沙坦组LVEDP和-dP/dtmax显著降低(P<0.01,见表1)。

表1 各组大鼠血压、心率及左心室血流动力学指标的比较

2.2 各组大鼠心肌间质纤维化改变

大鼠心肌Masson染色,蓝色染色为心肌胶原纤维;假手术组大鼠心肌细胞排列整齐,其间未见明显蓝色染色胶原纤维增生。TAC组大鼠心肌细胞排列紊乱,其间可见较多蓝色胶原纤维增生。缬沙坦组大鼠心肌组织排列不规整,其间伴少量蓝色染色胶原纤维增生。沙库巴曲缬沙坦组大鼠心肌细胞排列尚可,偶可见蓝色染色胶原纤维(见图1)。

图1 各组大鼠心肌组织Masson染色 (×400)Figure 1 Masson staining of rat myocardium in each group (×400)

2.3 各组大鼠心肌组织BNP、sST2水平的变化

与假手术组相比,TAC组大鼠心肌组织BNP及sST2水平显著升高(P<0.01);与TAC组相比,缬沙坦组BNP水平明显降低(P<0.05),沙库巴曲缬沙坦组BNP水平显著降低(P<0.01)。与TAC组相比,缬沙坦组sST2水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05);沙库巴曲缬沙坦组sST2水平明显降低(P<0.05,见表2)。

2.4 小动物超声检测大鼠心功能的变化

与假手术组相比,TAC组大鼠左心功能指标EF及FS值显著降低(P<0.01);与TAC组大鼠相比,沙库巴曲缬沙坦组EF及FS值明显升高(P<0.05),缬沙坦组EF及FS值显著升高(P<0.01,见图2)。

表2 各组大鼠心肌组织BNP及sST2表达水平

与假手术组比较,*P<0.05,**P<0.01;与TAC组比较,#P<0.05,##P<0.01图2 超声心动图检测各组大鼠LVEF及LVFS的变化Figure 2 Changes in LVEF and LVFS of rats in each group by echocardiography

2.5 Western blot检测大鼠心肌组织内质网应激GRP78、CHOP蛋白表达变化

与假手术组相比,TAC组心肌组织GRP78蛋白表达显著升高(P<0.01);与TAC组相比,缬沙坦组GRP78蛋白表达明显降低(P<0.05),沙库巴曲缬沙坦组GRP78蛋白表达显著降低(P<0.01)。与假手术组相比,TAC组心肌组织CHOP蛋白表达显著升高(P<0.01);与TAC组相比,缬沙坦组CHOP蛋白表达明显降低(P<0.05),沙库巴曲缬沙坦组CHOP蛋白表达显著降低(P<0.01,见图3)。

与假手术组比较,*P<0.05,**P<0.01;与TAC组比较,#P<0.05,##P<0.01图3 Western blot检测各组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP蛋白表达的变化Figure 3 Changes of the expression of GRP78 and CHOP protein in myocardial tissue of rats in each group by Western blot

3 讨论

心衰是由高血压、冠心病、糖尿病等心血管危险因素诱导心肌细胞损伤、肥大、凋亡,导致心肌重构,最终引起心功能不全。在心衰发生发展病理生理过程中,多种潜在分子机制如ERS、氧化应激、炎症因子激活等参与调控心肌细胞损伤及心肌重构[5-7],抑制上述相关分子机制激活可有效保护心肌细胞,改善心脏结构及功能。Okada等[8]研究表明,使用TAC术成功建立慢性心衰小鼠模型,小鼠心肌组织ERS相关因子表达升高,特异性阻断心肌细胞ERS激活可改善心肌重构。既往研究发现[9],使用TAC术8周成功建立压力负荷心肌重构大鼠模型,大鼠心肌细胞ERS相关因子GRP78、caspase-12表达升高。本研究采用TAC术建立心衰大鼠模型,术后10周,大鼠血压、心率较假手术组升高,心肌胶原纤维含量较假手术组增加,提示TAC术后大鼠后负荷加重,长期持续高后负荷诱导心肌组织发生较为明显间质纤维化,是心肌重构的重要病理基础。BNP为心衰的重要标志物,其升高程度与心衰严重程度呈正相关性,可溶性生长刺激表达基因2(sST2)蛋白为心衰患者心肌纤维化程度标志物,其升高提示心室重构严重程度,被认为与心衰患者的预后密切相关[10]。本研究结果显示,10周时TAC组大鼠心肌组织BNP和sST2表达较假手术组显著升高,心功能相关指标LVEDP和-dP/dtmax明显升高,EF、FS、LVPP和+dP/dtmax明显下降;表明TAC术后10周诱导大鼠心肌纤维化,触发心肌重构,引起心脏结构和功能改变,导致血流动力障碍,促进心衰发生发展,提示心衰大鼠模型成功建立。此外,研究显示TAC组大鼠心肌组织中GRP78及CHOP蛋白表达较假手术组显著升高,表明心衰大鼠心肌细胞ERS激活,ERS激活标志性因子GRP78在应激早期高表达且与内质网膜功能蛋白解离,以启动未折叠蛋白反应,有助于平复内质网功能紊乱,若外部诱因未解除且持续,ERS则启动CHOP促凋亡通路调控细胞凋亡;上述研究结果提示心衰大鼠心肌细胞发生ERS,心肌细胞ERS启动促凋亡通路,调控促凋亡因子CHOP表达升高,诱导心肌细胞凋亡,导致心肌纤维化程度加重及左室重构,是心衰发生发展的分子机制之一,与Okada等[8]既往研究一致。

临床治疗心衰的经典药物如醛固酮抑制剂、β受体阻滞剂、ACEI或ARB等均以抑制心肌重构、改善心功能为主要目标。虽然随着心衰治疗措施不断更新,心衰患者死亡率有所下降,但整体死亡仍较高[11]。因此,近年来治疗心衰新型药物层出,其中沙库巴曲缬沙坦钠是首个口服血管肾张素受体-脑啡肽酶抑制剂,缬沙坦可阻断RASS系统,沙库巴曲代谢产物可抑制内啡肽酶,阻止利钠肽降解,两者对心衰改善有协同、疗效放大作用,给心衰患者带来了新的希望[12]。PARAMOUNT及PARADIGM-HF两项大型临床研究表明[13,14],沙库巴曲缬沙坦钠治疗保留了射血分数的心力衰竭患者及射血分数降低的心力衰竭患者是有效的,能逆转心室重构,改善心衰患者症状和活动耐力,其效果要优于单用缬沙坦或依那普利。但目前对沙库巴曲缬沙坦协同保护心肌细胞、逆转心肌重构的潜在分子调控机制研究甚少。本研究分别使用沙库巴曲缬沙坦及缬沙坦给心衰大鼠灌胃,以探讨沙库巴曲缬沙坦对改善心肌结构及功能的优势及协同作用的分子机制。研究结果显示,与TAC组相比,缬沙坦组大鼠MAP、心率、BNP、sST2下降,心肌胶原蛋白量减少;沙库巴曲缬沙坦组以上指标明显或显著下降,心肌胶原蛋白量明显减少;表明沙库巴曲缬沙坦可明显减轻心脏后负荷、抑制心肌纤维化水平,改善心肌重构,有效控制心衰,与临床研究结果一致。与TAC组相比,缬沙坦组大鼠心功能相关指标LVEDP、-dP/dtmax下降,沙库巴曲缬沙坦组明显或显著下降;缬沙坦组EF、FS、LVPP、+dP/dtmax明显升高,沙库巴曲缬沙坦组明显或显著升高;表明沙库巴曲缬沙坦双药协同对逆转心衰大鼠左室重构以及改善心功能效果均优于单药缬沙坦,长期使用沙库巴曲缬沙坦干预使心衰大鼠心肌结构及功能接近正常,具体潜在协同分子机制尚需进一步研究。因此本研究进一步检测了大鼠心肌ERS相关因子GRP78、CHOP表达,结果显示与TAC组相比,缬沙坦组大鼠心肌GRP78、CHOP蛋白表达降低,沙库巴曲缬沙坦组GRP78、CHOP蛋白表达显著降低;表明沙库巴曲缬沙坦早期较缬沙坦更为有效抑制ERS激活,表现为早期应激启动蛋白GRP78表达显著降低;长期使用沙库巴曲缬沙坦更有效抑制ERS促凋亡通路激活,如促凋亡因子CHOP表达显著减少,避免心肌细胞凋亡事件发生;提示沙库巴曲缬沙坦一方面有效缓解促心衰诱因如心脏后负荷、神经体液因素激活,另一方面双药协同抑制心肌细胞ERS,避免促凋亡通路激活,多效共举有效保护心肌细胞,抑制重构及改善心脏功能。

综上所述,沙库巴曲缬沙坦通过两药协同抑制心肌细胞GRP78和CHOP表达,抑制ERS相关凋亡通路激活,保护心肌细胞,逆转左室重构及改善心功能,可能为其作用分子机制之一。沙库巴曲缬沙坦为目前临床有效治疗心衰的新药,本研究将为其提供新的理论依据。