跑台运动对糖尿病大鼠学习记忆及海马炎症因子和NGF表达的影响

赵 军，褚亚君，梁晋裕，付 芳

(1.晋中学院体育系，山西 晋中 030619； 2.中北大学体育学院，太原 030051)

糖尿病是一种以慢性高血糖和胰岛素分泌缺陷为主要症状的最常见的代谢性疾病之一，其发病率呈上升趋势，到2030年，全球约有3.66亿人将受到影响[1]。认知功能障碍是糖尿病最常见的并发症之一。Rama等[2]研究发现，1型糖尿病患者的学习能力和记忆巩固处理能力减弱，抽象判断能力不足，导致患痴呆的风险增大。动物实验表明STZ可引起大鼠认知障碍和记忆丧失[3]。然而，1型糖尿病认知功能下降的病理生理机制尚不清楚。

有学者研究认为，高血糖可导致机体免疫系统功能紊乱、增加促炎症介质如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和c反应蛋白(CRP)的过度释放，与高血糖引起的认知功能下降有关[4]。海马体是学习和记忆的关键脑区，对高血糖及炎性细胞因子非常敏感。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在神经元存活、轴突的生长和突触的形成方面发挥关键作用，被视为认知障碍的治疗靶点[5]。Cai等[6]研究发现，促炎因子活性增加可能会通过降低大鼠海马NGF及脑源性神经营养因子(BDNF)水平，与异氟醚麻醉后大鼠认知功能障碍有关，而脑室注射NGF可通过增强大脑抗炎因子活性改善与年龄相关的空间学习能力的缺失[7]。

有氧运动被认为是缓解糖尿病症状和改善认知功能的良好策略。研究表明，有氧运动可降低海马炎性细胞因子如IL-6和TNF-α水平[8]。运动可通过不同机制影响大脑，而运动对神经营养因子包括NGF的影响是最重要的机制之一[9]。本研究通过测量跑台运动8周对STZ诱导1型糖尿病大鼠学习记忆的影响，检测大鼠海马炎症因子(TNF-α 及IL-6)及NGF表达的变化，探讨长期跑台运动是否可改善1型糖尿病大鼠学习记忆能力并分析其可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3月龄SPF级雄性健康成年SD大鼠44只，购于山西医科大学实验动物中心[SCXK(晋)2019-0004]，体重200～220 g，室温22～24 ℃，湿度55～65%，所有动物均在山西医科大学动物房饲养[SYXK(晋)2019-0007]。本实验中涉及动物的使用及操作按3R原则给与动物人道关怀，并经学校实验动物管理伦理委员会批准(1401086000735)，符合国家实验动物福利相关规定。

1.2 主要试剂与仪器

STZ(链脲佐菌素，美国Sigma公司提供)；TNF-α、IL-6 试剂盒、兔抗NGF多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC 及DAB 显色试剂盒均由武汉博士德生物有限公司提供。血糖测量仪和试纸均购自美国强生公司；恒温培养箱(YLA-2000 型，上海阳光实验仪器有限公司)；光学显微镜(CX31型，日本 Olympus公司)；形态学图像分析软件(型号：JD- 801)，江苏省捷达科技发展有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠1型糖尿病模型建立

所有大鼠适应环境1周后，随机抽取22只大鼠为对照组(control group，CG；n=11)及运动组(exercise group，EG；n=11)，其余22只大鼠一次性腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，pH=4.5)65 mg/kg，注射STZ后3 d，使用血糖仪从大鼠尾静脉取血测量血糖水平，血糖超过16.7 mmol/L的大鼠为糖尿病大鼠。将22只糖尿病大鼠随机分为STZ组(n=11)及STZ运动组(STZ+exercise group，STZ+E；n=11)，随后运动组及STZ运动组大鼠进行8 周跑台运动，实验期间每天观察大鼠的精神状态、进食、饮水及尿便情况，跑台运动结束后第2天测量大鼠血糖水平，以血糖升高较对照组明显升高为判断模型成功标准。

1.3.2 跑台运动方案

根据Reisi等[10]描述的方法，造模成功后第2天，运动组及STZ+E组大鼠进行为期8周(5天/周，0坡度)的跑台运动。跑台训练前5 d跑台速度逐渐从5 m/min增加到15 m/min；第2周，跑台速度从16 m/min增加到22 m/min，以后每周跑速增加2 m/min，每次运动时间持续40 min，连续8 周。与此同时，对照组及STZ组不运动，正常实验室环境饲养8 周。

1.3.3 电Y迷宫实验程序

跑台运动结束后第2天所有大鼠进行电Y迷宫实验。

电Y迷宫实验由相同的三个臂组成(均装有15 W灯泡和电网)。实验时，先将大鼠放入迷宫适应3～5 min，然后训练大鼠电刺激还末开始时，只要安全区灯亮，大鼠就会立即逃往安全区的反应能力；动物受电击逃到安全区后，刺激信号灯继续作用10～15 s，灯熄后结束一次测试，大鼠所在支臂作为下一次测试的起点，依次重复。两次测试时间间隔为30 s，每次训练20次休息5 min，连续测试直到学会为止(学会标准：连续20次测试中有18次正确)，记录每只大鼠达到学会标准前所需的训练次数为大鼠的空间学习记忆成绩；学习测试结束后24 h，再用同样方法测试大鼠的记忆能力，记录大鼠30次电击过程中出现的错误次数，错误次数越少，说明记忆力越好。

观察指标如下：(1)达到标准所需的训练次数；(2)30次电击过程中出现的错误次数。

1.3.4 海马炎症细胞因子水平测量

Y迷宫测试结束后即刻将每组6只大鼠断头取脑，冰生理盐水冲洗干净后迅速分离海马称重，并用生理盐水按(1∶9)的比例制成10% 的组织匀浆，离心(12000 r/min，10 min)后取上清液，采用ELISA法，参照试剂盒说明进行海马炎症因子IL-6及TNF-α水平的测定。

1.2.5 海马NGF免疫组化检测

Y迷宫测试结束后即刻，每组剩余5只大鼠经麻醉后，4%多聚甲醛溶液心脏灌注取脑，石蜡包埋脑组织，海马经石蜡切片机连续冠状切片(片厚5 μm)，切片依次经梯度乙醇脱蜡、脱水后滴加30% H2O2室温孵育30 min，PBS液漂洗3次后滴加兔抗大鼠NGF(1∶200)，4℃过夜，PBS液漂洗3次后滴加生物素化羊抗兔NGF二抗孵育(37℃、30 min)，PBS液清洗后DAB室温显色10 min，苏木素复染2～3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

每组海马每个区选取10张切片，每张切片取5个视野采集图像，计数海马CA1、CA2、CA3及DG 区NGF阳性细胞数(number)及面积(μm2)，取其平均值作为最后结果。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 Y迷宫结果

与对照组比较，STZ 组大鼠达到学会标准训练次数显著增加(P<0.01)，运动组大鼠训练次数显著减少(P<0.05)，而STZ运动组大鼠与对照组比较，训练次数无显著差异(P<0.05)；与STZ组大鼠比较，STZ 运动组大鼠达到学会标准训练次数显著下降(P<0.05)。见表1。

与对照组比较，STZ 组及STZ 运动组大鼠30次错误次数均显著增加(P<0.01)，而运动组大鼠与对照组比较，30次错误次数无显著差异(P>0.05)；与STZ组比较，STZ 运动组大鼠30次错误次数显著下降(P<0.05)。见表1。

表 1 各组大鼠Y迷宫测试结果Table 1 Results of Y-maze test in every group rats

2.2 海马炎症因子结果

与对照组比较，STZ组大鼠海马炎症因子IL-6及TNF-α水平均明显增加(P<0.01)；而经过8 周跑台运动，与STZ 组大鼠比较，STZ运动组大鼠海马促炎因子TNF-α水平显著减少(P<0.05)，而IL-6水平无显著改变(P>0.05)；与对照组比较，运动组大鼠海马促炎因子 IL-6及TNF-α水平均无统计学差异(P>0.05)。见表2。

2.3 海马NGF表达结果

与对照组比较，STZ组大鼠海马CA1、CA3及DG区NGF个数和面积均明显下降(P<0.01)。经过8周跑台运动，与STZ组大鼠比较，STZ运动组大鼠海马CA1、CA3及DG区NGF个数和面积均明显增加(P<0.05，P<0.01)；而STZ组大鼠海马CA2区NGF个数和面积与对照组及STZ运动组大鼠比较均无显著差异(P>0.05)。与对照组比较，运动组大鼠除海马DG区NGF面积显著高于对照组外(P<0.05)，海马DG区NGF个数及海马其他3区NGF个数和面积与对照组比较均无显著差异(P>0.05)。见表3、表4、图1。

3 讨论

糖尿病被认为是认知功能障碍发展的一个独立危险因素[11]。研究发现，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者认知功能障碍的风险增加1.5倍，痴呆风险增加1.6倍[12]。Liu等[13]通过认知量表研究发现，糖尿病患者空腹血糖水平升高与认知功能下降有关。Li等[14]通过Y迷宫的自发性交替反应证实，高脂饮食及STZ诱导的糖尿病大鼠存在学习记忆障碍。Oliveira等[15]通过T迷宫实验也观察到了连续2 d腹腔注射STZ(90 mg/kg)诱导的糖尿病小鼠出现记忆缺陷。本研究使用Y迷宫试验证实，STZ诱导的糖尿病大鼠在Y迷宫中表现出空间学习及记忆缺陷，具体表现为与对照组比较，STZ 组大鼠

表2 各组大鼠海马炎症因子IL-6及TNF-α 水平结果Table 2 Results of the hippocampus inflammatory biomarkersin every group rats

表3 各组大鼠海马CA1、CA2区NGF表达结果Table 3 Results of NGF expression in the hippocampus CA1 and CA2 of rats

表4 各组大鼠海马CA3、DG区NGF表达结果Table 4 Results of NGF expression in the hippocampus CA3 and DG of rats

注：A1-D4: 冠状切面显示大鼠海马CA1、CA2、CA3及DG区NGF表达(箭头所指)。图1 NGF免疫组化检测结果Note. A1-D4, Coronal sections showing the NGF expression (arrows) in the hippocampus CA1, CA2, CA3 and DG of the rats．Figure 1 Results of NGF immumohistochemical staining

达到学会标准的训练次数及30次电击过程中出现的错误次数均显著增多。研究认为，运动可以减轻糖尿病引起的并发症，并对认知功能产生有益的影响，在预防神经退行性疾病中发挥重要作用[16]。Kim等[17]对出生后4 周的糖尿病幼鼠进行2 周跑台运动(5次/周，30 分/次)干预，结果发现跑台运动可通过增加海马齿状回细胞增殖和抑制凋亡减轻STZ对幼鼠短期记忆的损伤。本研究得到相同结果，与STZ组大鼠比较，STZ 运动组大鼠达到标准的训练次数及30次错误次数均显著下降，提示，长期跑台运动可改善糖尿病大鼠的学习记忆能力。

神经炎症被认为是认知能力下降、痴呆等神经退行性疾病发生发展的公认因素[18]。研究表明，1型和2型糖尿病患者CRP、TNF-α 及 IL- 6水平均显著上调，与糖尿病患者认知能力下降和痴呆的发展有关[19]。Yaffe等[20]人报道，血清CRP和IL-6水平升高的糖尿病患者存在认知功能受损，而血清CRP和IL-6水平正常的糖尿病患者认知功能正常，说明糖尿病患者促炎因子水平升高与认知功能受损密切相关。本研究结果发现，与对照组比较，STZ可导致大鼠海马促炎因子IL-6和TNF-α 水平显著增加，与Liu等[21]研究结果一致。越来越多的证据表明，运动可以通过调节神经炎症减轻神经退行性病变，增强大脑功能，发挥神经保护作用[22]。Chennaoui等[23]研究发现，7 周递增负荷跑台运动(18～25 m/min，60～120 分/次)可增强正常大鼠海马TNF-α及IL-6蛋白含量。但本研究发现，8 周跑台运动(16 m/min到22 m/min，持续时间40 min)对正常大鼠海马TNF-α 和IL-6水平无显著影响，这种差异可能与运动强度及持续时间有关。Wannamethee等[24]对4252名受试者(60～79岁)研究发现，体育锻炼水平与促炎因子(CRP及TNF-α 等)呈显著负相关。Andrade等[25]研究发现，8 周游泳运动(60 min/d，5次/周)可使高脂肪饮食和STZ诱导的糖尿病大鼠TNF-α水平及IL-6水平下降、抗炎因子IL-10水平增加。此外，Jahangiri等[26]发现，9 周跑台运动(15 m/min, 30 min/d)可通过下调海马TNF-α、IL-1β及 CRP水平，从而起到保护神经、促进大脑修复的作用，改善脂多糖诱导的大鼠学习和记忆障碍。本研究结果发现，经过8 周递增负荷跑台运动，与STZ组比较，STZ运动组大鼠海马促炎因子TNF-α 水平显著下降，但对促炎因子IL-6水平无显著影响，说明此运动具有一定的抗神经炎症作用。因此本研究8 周跑台运动改善STZ大鼠的学习记忆能力，可能与此运动抑制STZ导致的海马神经促炎因子的释放有关，具体机制需进一步研究。

NGF是一种重要的神经营养因子，广泛分布于中枢神经系统，可调节中枢和外周神经系统神经元的生长、发育、存活和分化，并参与突触可塑性。NGF是胰腺细胞合成和分泌胰岛素的重要调节因子，在调节STZ导致的大鼠学习记忆下降中起着关键作用[27]。STZ对糖尿病大鼠海马NGF水平变化的研究存在争议。Gürbüz等[28]采用ELISA法测定海马组织匀浆NGF的水平，结果发现与对照组比较，STZ诱导的青春期1型糖尿病幼鼠(出生后28 d)海马NGF水平无显著改变。而Zhang等[29]通过Western blot法测定海马NGF的水平，结果发现STZ诱导的糖尿病大鼠海马NGF水平显著下降。研究发现，海马是由相互联系的CAl、CA2、CA3及DG区等多个区域组成，且海马CAl、CA3和DG区在学习记忆中担负着尤其重要的作用[30]。本研究通过免疫组织化学方法发现，与对照组比较，STZ诱导的糖尿病大鼠海马CA1、CA3及DG区NGF表达均显著下降，但是海马CA2区NGF表达无显著变化，经过8周跑台运动，与糖尿病大鼠比较，糖尿病运动组大鼠海马NGF表达显著增加。最近研究报道，NGF与其受体(TrkA)结合可激活抗炎信号通路，增强抗炎物质IL-10等的释放降低炎症反应[31]。因此，本实验中跑台运动改善STZ大鼠学习记忆能力可能与此运动增加海马CA1、CA3及DG区NGF水平，增强海马抗炎能力，从而纠正STZ诱导的海马功能紊乱起到脑保护作用有关。但是，跑台运动导致STZ大鼠海马抗炎能力增强是否与NGF的增加有关，仍需要进一步研究证实。