一株猪流行性腹泻病毒的分离培养及其ORF3、sM 和N 基因的序列分析

陈果亮，阳 坤，唐青海，滕 威，张 可，杨 海，王芳宇

（1.衡阳师范学院生命科学与环境学院&海大集团湖南益豚生态农业有限责任公司联合研究中心，南岳山区生物资源保护与利湖南省重点实验室，湖南衡阳421008；2.海大集团湖南益豚生态农业有限责任公司，湖南岳阳414400）

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrheavirus，PEDV）为单股正链RNA 病毒，引起以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病[1]。2010 年以来，由于PEDV 的基因发生了变异，导致该病再一次爆发，迅速蔓延至中国、日本、加拿大和美国等养猪国家，死亡率在80%以上，对7 日龄以内的仔猪危害尤为严重[2-4]。PEDV 编码的ORF3 基因为非结构基因，调控猪流行性腹泻病毒粒子的产量，与PEDV 的致病力密切相关[5]。S 基因编码的蛋白在病毒粒子识别靶细胞、与宿主细胞膜融合并且诱导宿主机体产生中和抗体等方面发挥重要的作用[6]。M 蛋白是由M 基因编码的PEDV 的主要跨膜糖蛋白，在病毒粒子的组装和出芽过程中发挥着至关重要的作用，常被作为诊断PEDV 的重要靶基因[7]。N 蛋白是病毒粒子核衣壳的主要成分，在病毒复制和细胞感染过程中扮演着非常重要的角色[8]，且PEDV 基因遗传变异性高，加上近年来变异毒株弱毒疫苗的使用，对PEDV 的进行持续的分子流行病学监测十分必要。

本研究运用分子生物学技术对猪流行性腹泻病毒HuN-HY1902 毒株进行基因序列分析，为PEDV 的临床防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料与菌株

2019 年2 月，湖南某规模猪发生哺乳仔猪大面积腹泻，病料样品标记为HuN-HY1902，按照1∶5（w/v）加入0.9%灭菌NaCl 溶液，摇匀，12000 g，4 ℃离心5 min，取上清液采用0.22 μm 滤膜过滤，-80 ℃保存备用。DH5a 大肠杆菌感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 主要试剂

HindIII、BamHI、DAN Maker、pMD-19T、EX Taq 酶和PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒均来自TaKaRa 公司；KOD FX Neo 高保真酶为东洋纺(上海)生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和PCR 清洁试剂盒均购自Axygen 公司。

1.3 细胞与病毒的培养

在培养瓶中将单层vero 细胞消化，接种新培养瓶，加入含5%胎牛血清的MEM 培养基，待细胞长成60%左右的汇合度时，去掉培养基，PBS 洗涤3次，更换为无血清的MEM 培养基，按1∶10 的体积比将病料接种细胞中，加入终浓度为3μg/mL 的胰蛋白酶，轻轻混匀，轻轻摇匀，于37 ℃，5%CO2 培养箱中持续培养120 h，收集病毒液，于-80 ℃和37 ℃反复冻融3 次，用于下一代次接种。

1.4 病毒的血清学鉴定

免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）方法参考文献[9]改进后进行，待细胞长成60%左右的汇合度时，去掉培养基，PBS 洗涤3 次，更换为无血清的MEM 培养基，将1.3 中培养的F3 代病毒按1∶10的体积比将病料接种细胞中，加入终浓度为3 μg/mL 的胰蛋白酶，轻轻混匀，轻轻摇匀，于37 ℃，5%CO2培养箱中持续培养12 h，，PBS 洗涤2 次，加入33%的丙酮-PBS，固定15 min，弃掉固定液，干燥30 min，加入200 μL 1∶100 倍稀释的PEDV N 蛋白多克隆抗体（制备方法见文献[10]），37℃1 h。PBS 洗涤3 次。加入200 μL 1∶3 000 倍稀释的酶标二抗HRP-SPA，37 ℃1 h，PBS 洗涤3 次，加入100 μL AEC 底物显色液，37 ℃15 min。弃掉反应液，ddH2O 洗1 次，显微镜观察结果。

1.5 RNA 的提取与PEDV 第一链cDNA 的合成

取病毒样本200μL，用Trizol 试剂提取病毒总RNA，在PCR 管中加入RNA 8 μL、Random 6 primers(50 μM)1μL、dNTP Mixture(10 mM each)1μL，轻轻混匀，瞬时离心，65℃保温5 min 后，冰上迅速冷却5min。加入5×PrimeScriptIIBuffer 4μL、RNaseInhibitor(40U/μL) 0.5μL、PrimeScript IIRTase(200U/μL)1μL、RNasefreedH2O4.5μL，进行反转录反应：30℃10 min，45℃45 min，70℃15 min，4℃保存，第一链cDNA 产物置于-20℃保存备用。

1.6 引物的设计与合成

根据GenBank 中PEDV 基因组序列（GenBank登录号：JQ282909），用Primer Premier 5.0 软件设计PEDVORF3、sM、N 基因的PCR 扩增特异性引物，引物由深圳华大基因合成，引物信息见表1。

表1 引物序列及其反应条件

1.7 PEDV HuN-HY1902 毒株ORF3、sM 和N 基因的PCR 扩增

取反转录产物2μL 作为PCR 模板，采用引物PEDV-ORF3U1 和PEDV-ORF3L1 扩 增ORF3 基因、PEDV-sMS 和PEDV-sMR 扩增sM 基因，PEDV-N-F 和PEDV-N-R 扩增N 基因。PCR 反应体系为：DNA 模板2μL、KOD FX Neo 1μL、2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25μL、2 mM dNTPs 10μL、上下游引物各1μL、灭菌去离子水10μL，轻轻混匀，瞬时离心，在PCR 仪中进行反应：95℃10 min；98 ℃10 sec，62℃30 sec，68 ℃2.5min，35 个循环；68 ℃7 min；4℃保存。PCR 产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测、拍照记录结果。PCR 产物经试剂盒纯化、送深圳华大基因科技有限公司进行序列测定。

1.8 基因序列分析

在GenBank 中收集PEDV 基因序列信息，采用DNAStar7.0 软件对测定的HY1902 毒株基因序列进行对比分析，先用MEGA5.0 软件包中的ClastlW进行比对，采用最大值法（Maximum Likelhood）绘制该流行株基因的系统进化树。

2 结果

2.1 PEDV HuN-HY1902 毒株的免疫过氧化物酶染色鉴定

采用免疫过氧化物酶染色法检测分离培养病毒株HuN1902，结果显示，兔抗PEDV N 蛋白阳性血清（1∶200 稀释）与病毒感染细胞染色后细胞质呈棕红色，细胞核无着色，未接种病毒细胞无着色（图1），表明分离获得的HuN1902 毒株为PEDV 毒株。

2.2 PEDV HuN-HY1902 毒株的ORF3、sM 和N基因的PCR 扩增

PCR 扩增产物经1.2%的琼脂糖电泳检测，结果在约744 bp、1100 bp 和1400 bp 处得到了特异性的扩增条带（图2），与预期片段长度相符。PCR产物

2.3 PEDV HuN-HY1902 毒株的ORF3、sM 和N基因序列分析

2.3.1 HuN-HY1902-ORF3 基因核苷酸序列与参考毒株同源性与遗传进化分析

表2 数据表明，所扩增到的毒株ORF3 基因与美国毒株Missouri130 相似性最高（99.7%），与中国几年来的新流行毒株CH/SCMY/2018 相似性为99.6%；与疫苗毒株CV777 相似性96%。

应用MEGA5.0 软件将该毒株的ORF3 基因与国内外已发表的毒株构建遗传进化树，结果表明，PEDV HuN-HY1902 毒株与Missouri130-2015 毒株以及2018 年中国分离毒株CH-SCMY-2018 处于同一分支，均属于基因Ⅰ群，与处于Ⅱ群的经典疫苗株CV777、SM98 亲缘关系较远（图3），两个不同的基因群毒株在进化上明显处于不同分支。

表2 HuN-HY1902 ORF3、sM 和N 基因与参考毒株相应基因核苷酸序列相似性比较分析

2.3.2 HuN-HY1902-sM 基因核苷酸序列与参考毒株同源性与遗传进化分析

数据表明，所扩增到的毒株sM 基因与国内CH-SCMY-2018、BJ-2011-1 毒株和斯洛文尼亚SLO-JH-11-2015 毒株相似性最高（96.3%），KF452323--USA-Indiana-17846-2013 相似性为96.1% ；PEDV/USA/Missouri130/2015 相似性为96.1%；与疫苗毒株CV777 相似性93.9%。

应用MEGA5.0 软件将该毒株的sM 基因与国内外已发表的毒株构建遗传进化树，结果表明，PEDV HuN-HY1902 毒株与CH-SCMY-2018 处于同一分支，均属于基因Ⅰ群，但与经典疫苗CV777、SM98 和DR13 亲缘关系较远（图4）。

2.3.3 HuN-HY1902-N 基因核苷酸序列与参考毒株同源性与遗传进化分析

数据表明，所扩增到的毒株N 基因与中国几年来的新流行毒株CH/SCMY/2018 相似性最高（98.6%）；与美国流行毒株KJ399978-OH851 相似性98.5%，KF452323-USA-Indiana-17846-2013 相似性为98.5%；PEDV/USA/Missouri130/2015 相似性为98.1%；与疫苗毒株CV777 相似性95.1%。

进化分析表明，PEDV HuN-HY1902 毒株与2018 年的流行毒株如 CH-SCMY-2018、PEDV-MEX-QRO、处于同一分支，均属于基因Ⅰ群。与经典疫苗株CV777、SM98、DR13 不在同一分支，亲缘关系较远（图5）。

3 讨论

猪流行性病于1971 年首次在欧洲被发现，我国自2010 年以来，PEDV 感染出现大面积爆发。近几年，我国PEDV 变异株变异频率较高、持续流行，给养猪业造成了较为严重的经济损失[11,12]。目前，研究表明，最有效的防治手段为接种疫苗，但是由于其变异较快，防治难度逐渐增大[13]。

本研究通过vero 细胞分离培养、血清学鉴定，成功分离得到了一株PEDV 病毒。采用RT-PCR 扩增了PEDV HuN-HY1902 毒株N、sM 和ORF3 基因。运用MEGA 软件将本毒株与GenBank 中相关的毒株进行比对分析并制作进化树。经比对发现，本毒株ORF3 基因核苷酸序列与美国流行毒株PEDV/USA/Missouri130/2015 相似性最高，为99.7%；N 基因核苷酸序列与中国几年来的新流行毒株CH/SCMY/2018 相似性最高，为98.6%；sM 基因核苷酸序列与中国几年来的新流行毒株CH/SCMY/2018、BJ-2011-1 相 似 性 最 高，均 为96.3%；相对而言，ORF3、N、sM 基因核苷酸序列与疫苗毒株CV777 相似性均较低，分别为96%、95.1%、93.9%，说明该毒株和疫苗毒株亲缘关系较远。进化分析显示，该毒株的ORF3、sM 和N 基因的核苷酸序列与2018 年四川绵阳流行毒株CH/SCMY/2018 处于同一分支，同属于I 型，而与经典毒株CV777、SM98 的亲缘关系较远。这些数据表明，HuN-HY1902 毒株属于近几年新流行的变异毒株。这些数据提示：（1）PEDV 的变异在持续，需要加强对该病毒的分子流行病学监测，及时掌握其变异特征，以次指导PEDV 疫苗的改进和新疫苗的开发；（2）猪场要加强生物安全，特别关注生猪调运、引种等带来的PEDV“引进”风险，加强病原的检测；（3）猪场在商品化的疫苗选用方面，应尽可能的选择与本场流行毒株基因型相匹配的疫苗毒株。本试验分离并鉴定了一株PEDV 新流行毒株，命名为PEDV HuN-HY1902 毒株，为PEDV 的疫苗免疫和科学防控提供了科学依据。