非小细胞肺癌EGFR基因突变与E-cadherin、Vimentin表达的相关性

郭宁宁

（广东省惠州市第三人民医院肿瘤内科，广东 惠州 510000）

肺癌严重影响人类身体健康，非小细胞肺癌在所有肺癌中占据80%，以手术为主、放化疗辅助治疗的方式广泛用于肺癌，然而部分非小细胞肺癌患者5年存活率不足20%[1]。研究发现非小细胞肺癌多数患者中均可检测到EGFR基因突变，且EGFR基因突变影响患者生存状况[2]。因此，及早寻找影响EGFR基因突变原因对于缓解治疗效果迫在眉睫。过往研究发现上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤浸润及转移过程中尤为重要，上皮型标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）的丧失与间质型标志蛋白波蛋白（vimentin）的获得为EMT转化主要特征，二者均可反映疾病状况[3，4]。然而目前 E-cadherin、Vimentin 在非小细胞肺癌患者EGFR突变中的作用，目前尚不明确。本研究通过检测非小细胞肺癌EGFR基因突变患者E-cadherin、Vimentin的表达，旨在探究两者与非小细胞肺癌患者EGFR突变的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2018-05～2019-03在本院进行治疗的104例非小细胞肺癌患者进行研究，男性61例，女性43例，年龄37～79岁，平均年龄58.95±12.16岁，病理类型：鳞癌31例，鳞腺混合癌6例，腺癌67例，I～II期56例，III～IV期 48例，EGFR基因突变61例，EGFR野生型43例。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：（1）患者均经病理学检测为肺癌；（2）年龄不超过80岁；（3）符合TNM肿瘤病理学分型标准[5]；（4）患者资料完整。排除标准：（1）术前接受过放疗、化疗等肿瘤相关的治疗；（2）合并其它部位恶性肿瘤；（3）肝、肾等器官发生重要损伤；（4）妊娠、精神疾病患者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要试剂与仪器DNA提取试剂盒（KL111201）购自美国Omega公司；免疫组化试剂盒（WE0316）购于北京百奥莱博公司；PCR仪（7500）购于美国ABI公司；E-cadherin、Vimentin抗体均购于英国Abcam公司；EGFR基因引物均在上海生工生物工程有限公司合成；显微镜BX51购于日本奥林巴斯公司。

1.3.2 肿瘤组织中EGFR基因突变检测采用Primer5.0软件设计引物，引物序列参照基因组DNA提取试剂盒提取组织DNA，经检测浓度与纯度后，采用PCR扩增反应检测EGFR基因突变情况，反应体系：2mmol/L氯化镁，250umdNTP，2.5UTaqDNA，上下游引物各0.3uM。反应条件控制：94℃5min，94℃反应60s，57℃退火60s，72℃反应1min，反复循环30次。取5uL反应产物，经2%琼脂糖凝胶电泳观察条带大小，剪取正确条带，经纯化后进行酶切反应：0.15uL Exon-I酶，0.5uL SAP，4uL PCR反应产物，0.35uL ddH2O，酶切条件：37℃恒温反应60min，72℃15min，经循环反应后进行测序分析，统计各位点突变情况。

1.3.3 免疫组化检测肺组织中E-cadherin、Vimentin表达情况收集术中切除的肺组织，在10%中性福尔马林溶液中过夜固定，进梯度乙醇溶液水合、二甲苯透明、浸蜡后进行石蜡包埋，制备肺组织石蜡切片（4μm），经烘烤后，采用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，用0.01M柠檬酸钠（PH6.0）缓冲液对切片进行抗原热修复20min，洗涤后添加3%过氧化氢孵育10min，清洗后加入10%山羊血清常温下孵育10min，采用E-cadherin、Vimentin一抗（1：300）4℃过夜孵育切片后，用辣根过氧化物酶标记的IgG二抗在常温孵育切片1h。PBS清洗3次，每次5min。采用100μL DAB溶液对切片进行显色反应，在显微镜下观察直至显色，冲洗后用苏木精进行复染，然后在1%盐酸中5s后用水冲洗，经乙醇脱水、二甲苯透明处理、中性树脂封片后在显微镜下观察切片中E-cadherin、Vimentin蛋白阳性表达情况。每张切片挑选10个视野，E-cadherin主要定位在细胞膜，Vimentin主要定位在细胞浆或细胞质中，采用Image-J计算阳性染色细胞百分比，蛋白阳性表达率=染色细胞数/细胞总数。

1.2 统计学处理

采用统计学软件SPSS 21.0进行数据分析，当P＜0.05时，则代表差异具有统计学意义。计数资料以%描述，行χ2检验；计量资料以表示，两组间对比行t检验，采用Pearson相关性分析E-cadherin、Vimentin蛋白阳性表达与非小细胞肺癌患者临床参数及EGFR突变的关系。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌患者EGFR基因突变情况

非小细胞肺癌患者中（104例），EGFR突变61例，其中33例为21号外显子点突变，20例为19号外显子缺失突变，4例为18号外显子突变。2例20号外显子突变，2例为18号和20号外显子共突变。临床分析发现非小细胞肺癌患者EGFR基因突变与患者性别、肿瘤组织类型、患者吸烟有关（P＜0.05）；与年龄、肿瘤分期无关（P＞0.05）（见表1）。

表1 非小细胞肺癌患者EGFR基因突变与临床参数的关系

2.2 非小细胞肺癌患者EGFR基因突变患者E-cadherin、Vimentin表达情况

与EGFR基因野生型患者相比，EGFR基因突变者肺组织中E-cadherin表达显著升高，Vimentin表达显著降低（P＜0.05）（见表2）。

表2 不同EGFR基因表型患者E-cadherin、Vimentin表达比较

2.3 E-cadherin、Vimentin与患者临床病理参数的关系

E-cadherin、Vimentin与非小细胞肺癌患者组织类型相关（P＜0.05）；与年龄、性别、肿瘤分期、吸烟无关（P＞0.05）。

表3 非小细胞肺癌患者E-cadherin、Vimentin表达与临床参数的关系

2.4 非小细胞肺癌患者E-cadherin、Vimentin相关性分析

Pearson相关性分析显示，非小细胞肺癌患者E-cadherin与Vimentin呈显著负相关（r=-0.483，P＜0.05）（见图1）。

3 讨论

EGFR主要定位在人7号染色体，其功能区主要位于18～24号外显子区域，过往研究发现EGFR基因突变多集中在21号外显子，为858号亮氨酸转变成精氨酸；20号外显子突变出现较少，主要为770～775号密码子突变[6]。本研究发现非小细胞肺癌患者中，EGFR突变61例，其中33例为21号外显子点突变，2例20号外显子突变，说明非小细胞肺癌患者EGFR突变大多数集中在21号外显子，20号外显子较少，与过往研究相符合[7]。研究发现肺癌患者EGFR基因突变主要发生在女性肺腺癌患者中[8]。本研究发现非小细胞肺癌女性患者EGFR突变率明显高于男性，腺癌突变率明显高于非腺癌，提示非小细胞肺癌患者EGFR基因突变在不同性别中表现出差异，可能受某些因素影响。

E-cadherin属跨膜糖蛋白，通过结合Catenin介导细胞粘附，在组织结构结构维持中发挥重要作用。研究发现在上皮细胞肿瘤中E-cadherin表达水平降低会造成细胞粘附能力下降，而E-cadherin表达降低也会进一步造成细胞去分化导致高侵袭性[9]。基础研究发现上皮细胞中E-cadherin过表达能够抑制细胞中增殖，诱导细胞凋亡，造成细胞连接松散，侵袭能力增强[10]。这些研究均说明E-cadherin的异常变化会影响肿瘤的表型变化。Xing等研究发现在MCF-7等癌细胞中过表达E-cadherin后，能明显降低的增殖率，提示E-cadherin可能在EGFR分子靶向治疗的过程中发挥重要作用[11]。当肿瘤出现EMT后，EGFR基因突变率升高，表明肿瘤EMT状态与EGFR基因突变密切相关。本研究发现与EGFR基因野生型患者相比，EGFR基因突变者肺组织中E-cadherin表达显著升高，且E-cadherin表达与癌组织类型相关，进一步进行Logistic回归分析发现E-cadherin是影响非小细胞肺癌患者EGFR基因突变的危险因素，推测E-cadherin高表达可促进癌细胞侵袭、出现EMT增加的非小细胞肺癌EGFR基因突变，进而加重病情。

Vimentin以往作为间叶组织来源肿瘤特异标志物，而在上皮肿瘤细胞中Vimentin过表达后会进一步促使上皮间质转化，加速肿瘤转移、侵袭等。基础研究证实抑制癌细胞中Vimentin表达后可降低肿瘤细胞的侵袭、转移，抑制EMT进程[12]。Richardson等报道对化疗药物不敏感的肺癌患者组织中Vimentin高表达，说明Vimentin高表达与癌症患者化疗效果不佳有关，可用于预测癌症患者临床疗效[13]。Weng等研究发现Vimentin表达水平升高后造成癌细胞上皮-间质转化[14]。本研究发现与EGFR基因野生型患者相比，EGFR基因突变者肺组织中Vimentin表达显著降低，且Vimentin表达与癌组织类型相关，进一步进行Logistic回归分析发现Vimentin与非小细胞肺癌患者EGFR基因突变密切相关，说明在EGFR基因突变受到EMT的影响，推测Vimentin低表达可促进肿瘤转移、侵袭，加速EMT转化，EGFR基因突变增高，加重病情。

在EMT过程中，E-cadherin、Vimentin以相反的作用共同参与肿瘤细胞的转移、浸润、侵袭等生物过程。Mao等研究发现Vimentin能够通过下调E-cadherin表达进而促进血管癌细胞的增殖、侵袭、转移[15]。本研究经Pearson相关性分析发现非小细胞肺癌患者E-cadherin与Vimentin呈现负相关，推测两者可能以负调控作用影响EMT过程，进而参与非小细胞肺癌患者EGFR基因突变过程。

综上所述，非小细胞肺癌患者EGFR基因突变多集中在21号外显子，在女性非腺癌患者中发生概率较高，EGFR基因突变患者E-cadherin阳性表达较高，Vimentin阳性表达较低，二者可能共同影响EGFR基因突变。然而临床治疗中是否能得出结论，还需要长期随访。