西北荒漠区野生黑果枸杞种质资源遗传多样性分析

王红梅，陈玉梁，马彦军，刘新星，石有太，王立光，杨 钊

(1.甘肃省农业科学院 生物技术研究所，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院 黄羊试验场，甘肃 武威733006；3.甘肃农业大学 林学院，甘肃 兰州 730070)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)属茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.)多年生落叶灌木，具有很强的耐旱、耐盐碱性，为我国西北荒漠地区特有的野生植物资源，主要分布于青海、甘肃、新疆和宁夏等省区[1-2]。黑果枸杞作为一种药食同源植物，其成熟果实中包括氨基酸、维生素、微量元素、多糖、总黄酮等营养成分，医药活性物质种类多，含量丰富，具有抗肿瘤、软化血管、防衰老及增强免疫力等保健和药用价值[3-5]；其干果中花色苷的含量高达369 0 mg/100 g，稳定性好, 着色力强，是理想的食用天然花色苷[6-7]。黑果枸杞抗寒、抗旱、耐盐碱，根蘖性强，以群落形式分布于干旱盐碱地、荒漠、戈壁与半荒漠地区，是防风固沙、荒漠化土壤改良的优良植物资源，具有极高的生态学价值[8]。

枸杞为常异花授粉植物，多数自交不亲和，基因型高度杂合，种子繁育后代容易发生性状分离，通过营养繁殖方式选育出的无性系在形态上极为接近[9]。黑果枸杞分布地域广、繁殖方式多样，野生种经过人工栽培驯化以及自然遗传变异过程，形成了许多栽培品种及类型。但目前由于枸杞基因组基础研究薄弱，遗传信息缺乏，品种间遗传背景不清楚，亲缘关系模糊、分类不明确，优良种质的特性难以通过品种间的自然杂交被利用[10]。近年来，随着市场需求量的持续上升，黑果枸杞人工栽培和推广速度加快，不同地区之间品种资源交流愈加频繁，造成同物异名和同名异物现象非常普遍，使得枸杞品种鉴定困难[11]。因此，开展黑果枸杞种质资源亲缘关系及遗传多样性的研究，对黑果枸杞种质资源分类、鉴定评价和利用具有重要意义。

简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)分子标记是以特异引物PCR为基础的分子标记技术，一般由1～6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。SSR标记在基因组间广泛分布，具有重复性好、多态性高、扩增结果稳定、检测手段简便易行等优点，目前被广泛应用于植物的品种鉴定、基因定位、遗传作图、分类与进化等诸多领域。SSR标记丰富的多态性信息，能准确高效地鉴别出大量的等位基因，因而适合品种的鉴定，特别是亲缘关系非常近而用其它方法无法区分的品种[12]。本研究以甘肃、青海、宁夏、新疆等地采集到的黑果枸杞种质为材料，初步建立了黑果枸杞SSR分子标记指纹图谱，从分子水平上揭示不同来源黑果枸杞遗传差异和亲缘关系，以期为黑果枸杞资源鉴定和有效利用研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究材料分别采集于甘肃、青海、宁夏、新疆等西北荒漠地区(表1)，共22份，其中黑果枸杞19份均为野生资源，红果枸杞2份为栽培资源(对照材料)，黄果枸杞1份为栽培资源(对照材料)，由甘肃省农业科学院生物技术所石有太助理研究员与甘肃省农业大学林学院马彦军副教授联合采集、鉴定并定植于甘肃农业大学林学院和黄羊试验场种质资源圃。

表1 枸杞种质来源和生境Tabel 1 Habitats and localities of the sampled L. ruthenicum

1.2 试验方法

1.2.1 枸杞DNA的提取

采集枸杞新鲜叶片0.2 g，在液氮中磨成粉末，采用试剂盒(TIANGEN DP320)提取样本基因组DNA，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，最后用dd H2O将每个样品的DNA稀释至50 ng/L，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 SSR引物

61对SSR引物序列信息来源于公开发表的枸杞及其近缘属植物的SSR标记[12-15]。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增与产物检测

1.3 数据统计分析

根据PCR扩增产物电泳结果统计条带，按在凝胶相同迁移位置上有无条带进行记录，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”构成“0，1”矩阵。采用POPGENE 1.32软件计算SSR标记检测到的等位基因数(Number of alleles,Na)、有效等位基因数(Ne)、多态位点百分率(Percentage of polymorphic bands, PPB)、Nei’s遗传多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)；利用NTSYS-pc 2.10软件计算供试材料的遗传相似系数(GS)，并进行UPGMA聚类分析，通过Tree plot模块绘制聚类图。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选及多态性分析

选取遗传背景和表型性状差异较大的敦煌孟家桥黑果枸杞和宁杞1号红果枸杞，分别以61对SSR引物对其基因组DNA进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从中筛选出多态性高、电泳谱带清晰且重复性好的引物37对(表2)，用于22份供试材料的遗传多样性分析。37对引物在22枸杞材料中共检测到233个基因位点，其中多态性位点213个，多态性位点百分率为91.4%；扩增片段长度在100～400 bp之间(图1)；单引物对可扩增出2～14条谱带，平均为6.3条。SM0138、SF80、SF74、SF53等24对引物检测到的等位变异，其多态性位点为100%，可用于枸杞资源材料的种质鉴定和遗传多样性研究。用POPGENE1.32软件对试验数据分析计算，22个枸杞材料平均等位基因数Na为1.898 3，有效等位基因数Ne为1.331 4，遗传多样性指数H为0.210 6，Shannon信息指数I为0.338 4，说明供试材料遗传多样性较为丰富，且SSR标记能有效的揭示枸杞种质材料的多态性。

表2 SSR引物序列和扩增情况Tabel 2 Primers sequences and amplified results

续表2 SSR引物序列和扩增情况Tabel 2 Primers sequences and amplified results

图1 引物对CAN130829、TOM180、SSR22对22份枸杞材料的PCR扩增结果Marker: 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp，箭头所指为多态性位点。Fig.1 The results of PCR amplification of L. ruthenicum from 22 materials by primers CAN130829, TOM180 and SSR22, Marker: 600, 500, 400, 300, 200, 100bp, the arrow points to polymorphic sites.

2.2 遗传相似性分析

以22份枸杞材料和233个位点的条带数据为原始矩阵，利用NTSYS-pc2.10 软件计算供试材料之间的遗传相似系数(GS)。结果表明，任意2份材料间的GS数值在0.483 1～0.936 4之间，平均GS为0.628 6(表3)。其中来自大武口十分沟的黑果枸杞和来自阿克塞多巴沟的黑果枸杞遗传相似系数最大，为0.936 4，说明二者亲缘关系最近；其次宁杞1号和宁杞2号之间遗传相似系数为0.889 8，说明这2个红果枸杞的遗传背景相近；除过精河托里黄果枸杞和基布克村黑果枸杞之外，红果枸杞宁杞1号、宁杞2号和其他黑果枸杞之间的遗传相似系数均低于平均值，以宁杞1号与德令哈莲湖的枸杞之间的遗传相似系数最小，为0.483 1，表明宁夏红果枸杞与青海德令哈莲湖黑果枸杞之间存在较大的遗传差异，亲缘关系最远。22份材料GS数值在0.483 1～0.936 4之间，跨度较大表明供试材料之间遗传多样性较为丰富。

基于SSR的扩增结果，采用UPGMA法进行聚类分析，得到22份供试材料的亲缘关系树状图(图2)。在遗传相似系数0.61处，所有供试材料分为2个类群，Ⅰ类和Ⅱ类，2个宁夏红果枸杞与青海格尔木和新疆基布克村的黑果枸杞聚为Ⅰ类，其中宁杞1号和宁杞2号的相似性系数为0.889 8，遗传背景较近；相似系数为0.779 7时，来自新疆精河县的黄果枸杞和不同地区的17份黑果枸杞材料聚为Ⅱ类，精河的黄果枸杞独立聚类，17份黑果枸杞材料全部聚为一类；至此，红果枸杞、黄果枸杞与黑果枸杞之间可完全分类。来自甘肃、青海、宁夏和新疆的17份黑果枸杞材料，在相似系数0.800 8处聚为2个亚类，来自宁夏兴庆、惠农和中卫的黑果枸杞独立聚为1个亚类，其余14个材料另外聚为1个亚类，宁夏和甘肃地理来源相近的部分材料聚为一类，新疆的种质材料在聚类图中分布相对分散。聚类结果表明，SSR标记适用于枸杞属植物种质遗传多样性分析及遗传关系研究；不同种类枸杞对系统聚类结果影响较大，地理来源不同的材料在聚类图中既有区别又有交叉，地域分布规律性不明显。

3 讨论

种质资源是遗传育种的物质基础，遗传多样性水平的高低代表了该物种在特定环境中基因的丰富程度。对种质资源遗传多样性进行研究是种质资源有效利用和优良新品种培育的重要环节[16]。目前，我国在枸杞种质资源生产和经营方面还很不规范，尤其是黑果枸杞大多处于野生状态，没有栽培品种或者优良品系，引种和栽培异常混乱，多数“品种”(系)在形态上相似性极高或同一“品种”(系)在不同地区皆有栽培，给枸杞种质鉴定带来一定困难[17]。DNA分子标记是在分子水平上直接对DNA进行研究，能克服林木世代周期长、遗传基因高度复杂等问题，是进行遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定及系统发育等研究的有效工具，更是客观、高效及准确的种质鉴定技术[18]。

本研究采用SSR分子标记技术对来自甘肃、青海、宁夏、新疆不同省区的22个枸杞材料进行遗传多样性分析，筛选出37对SSR引物共检测到233个等位变异，其中多态性位点213个，平均每个引物扩增条带数为6.3条，多态性位点比率为91.4%，遗传相似系数在0.483 1～0.936 4之间，平均GS值为0.628 6，在分子水平上证明了不同省区供试黑果枸杞之间差异较大，遗传多样性较为丰富。通过遗传距离测算明确了供试材料间亲缘关系的远近，以大武口十分沟和阿克塞多巴沟的黑果枸杞遗传相似系数最大(0.936 4)，可能是由于地区之间相互引种引起枸杞遗传背景相似；而表型性状非常相似的宁杞1号和宁杞2号借助分子标记可以有效区分开来，充分证明了SSR标记技术可以从分子水平上有效鉴别枸杞种质间的遗传差异。本研究筛选出的37对SSR引物，将为枸杞品种鉴定和今后枸杞遗传育种研究提供技术支撑。

图2 22个枸杞样本的UPGMA聚类分析图Fig.2 The UPGMA dendrogram of 22 samples based on SSR markers

根据聚类分析来判断枸杞种质材料之间亲缘关系远近比较准确。聚类分析发现，在相似系数0.61处所有供试材料分为2个类群，Ⅰ类和Ⅱ类，2个宁夏红果枸杞与青海格尔木和新疆基布克村的黑果枸杞聚为Ⅰ类，其中宁杞1号和宁杞2号的遗传背景较近，相似性系数达0.889 8；在相似系数为0.779 7水平，精河的黄果枸杞独立聚类，17份黑果枸杞材料全部聚为一类，试验结果可将红果枸杞、黄果枸杞与黑果枸杞之间可完全分类。来自甘肃、青海、宁夏和新疆的17份黑果枸杞材料，在相似系数0.800 8处聚为2个亚类，宁夏兴庆、惠农和中卫的黑果枸杞独立聚为1个亚类，其余14个材料另外聚为1个亚类。本研究中供试材料的聚类分析结果与供试材料的种类有较好的一致性，同一地理来源材料在不同程度上聚为一类(如来自于宁夏、甘肃的部分材料)，不同来源地黑果枸杞材料在聚类图中既有区别又有交叉，尤其新疆的材料在几个亚类中分布相对分散。分析认为风媒和鸟类携带不同地域枸杞的花粉和种子交叉传播，可能导致部分地理来源不同的材料遗传背景相似；同时西北荒漠区气候环境的复杂性影响枸杞的自然选择方向，导致地理来源相近的材料遗传变异较大，因此出现了地理来源相近的材料被归入不同类群。