甜菜红素合成关键基因不同光照条件下的差异表达

2020-12-08马冰雪罗成飞代翠红

中国甜菜糖业 2020年3期

马冰雪，罗成飞，代翠红

(哈尔滨工业大学化工与化学学院)

0 前言

甜菜色素普遍存在于石竹目中，是一类水溶性的含氮植物色素，系毗咙类衍生物，因最早提取于甜菜而得名，均是由石竹目属(除石竹科和粟米草科)的植物产生[1-2]。

甜菜色素分为两大类：甜菜红素和甜菜黄素。其中前者是生色基团甜菜醛氨酸(betalamicacid,BA)与环状多巴(cyclo-DOPA)缩合之后的产物，而后者则是甜菜醛氨酸与胺类或氨基酸类反应的产物。甜菜红素是红甜菜的主要色素，主要成分为甜菜红苷。黄色和紫红色的甜菜色素一般仅存在于石竹目中，其生物学作用与花青素类似。目前甜菜色素和花青素从未在两个不同植物中发现。两者是否有进化过程中的排斥现象至今仍未有正确解释；然而，已经被证实的是，在生化水平上，在产生甜菜红素的植物中关于花青素合成的酶并不表达[3]。此外，与甜菜红素相关的色素在真菌中也有研究[4]。一定程度上，相似色素在植物中和真菌中的共同存在意味着其在甜菜色素生物合成关键酶的进化上趋同。

1 材料与方法

1.1 植物材料

食用红甜菜品种：工大食甜1号。

1.2 实验方法

1.2.1 甜菜幼苗不同化感物质处理下的培养

1.2.2 化感物质的获得

本实验中的供试秋葵，大豆，玉米，菊苣、甜菜的残根系来自糖业研究所试验田。选取成熟干燥未腐烂茎、根实验原料于烘箱中烘干，粉碎至 2-5 cm 左右。将各作物粉碎后分别以 1∶30(质量g：体积 ml)在30℃下浸提72 h静置过滤，除去残渣获得浸提液[5]。

1.2.3 发芽实验

种子前处理阶段完全按照“GB19176-2010”的方法，4次重复6个处理(秋葵、大豆、玉米、菊苣、甜菜的浸提液,对照为水)。发芽温度在设置为24℃，光照强度为5 000 lx，光照时间8H，试验持续时间为10 d。初次计数时间为4 d，之后隔天计数，末次计数时间为10 d，均以正常幼苗数计算。试验结果以粒数的百分率表示[6]。

种子的发芽势、发芽率、发芽指数(GI)和活力指数(VI)以及对化感作用效应指数(RI) 可以通过下列公式计算：发芽势(%)=前4天种子发数/供试种子数×100%；发芽率(%)=前7天种子发芽数/供试种子数×100%；发芽指数(GI)=∑Gt/Dt；活力指数(VI)=GI×S。式中，Gt为在t日的发芽数，Dt为发芽天数，S为幼苗的生长势(芽长度)，本次数据处理采用的芽长度为第10 d最后一次记录时的出芽长度。化感作用效应指数(RI)计算公式如下：RI=1-C/T，其中C为对照值，T为处理值，RI>0时为促进作用，RI<0时为抑制作用，绝对值的大小代表作用强度的大小[7]。试验数据用Excel、SPSS软件处理分析。

1.2.4 不同光质下甜菜幼苗的培养与处理

本实验在不同颜色冷光质下，对甜菜进行了培养。培养温度为25℃，光照时间16 h/d。不同光质处理为：自然光、蓝、绿、红(电压：220 V，功率：14 W)共4个处理方式。在播种后的第7 d进行第一次的取样，之后每隔7 d进行取样，共取样5次，每次必须保证随机选取，选取10株幼苗进行鲜重，株高，叶面积等生理指标的测量。同时，对每一时期的幼苗进行取样冻存(液氮取样，-80℃冻存)用以检测甜菜UDP及TYR 基因不同时期的表达量。

1.2.5 甜菜红素的提取与测定

以上述不同处理条件下不同时期的甜菜苗为样品，称取0.1 g甜菜新鲜组织，液氮中进行研磨。研磨完迅速加入1.6 mL预冷甲醇，剧烈振荡混匀。于4℃放置30 min，离心10 min去上清，用双蒸水重悬沉淀，4℃ 30 min，12 000 r/min离心取上清。用紫外分光光度计在536 nm下测吸光值。根据甜菜红素的摩尔吸光系数5.66×104计算甜菜红素的绝对含量[8]。

1.2.6 实时定量PCR(qRT-PCR)分析

按照SYBR®Premix Ex Taq II试剂盒说明进行荧光定量PCR实验，实验仪器ABI 7300荧光定量PCR仪，使用试剂SYBR®Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)，方法参照试剂盒说明书，每个样进行三次技术重复。根据NCBI提供的甜菜基因序列进行基因序列比对，根据结果中保守区的核苷酸序列，采用生物学软件Primier5.0设计引物，内参基因为BvICDH。

每个样品进行3次生物重复和2次技术重复。

2 结果与分析

2.1 不同化感物质对甜菜发芽的影响

由表1可知，5种化感物质对甜菜种子萌发的影响不同。其中甜菜化感物质的抑制作用最强，在其处理下，甜菜种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数均明显低于对照，RI值均为负值，这一现象也说明了甜菜对自身的生长有一定的毒性，与已经报道的甜菜连作障碍相一致；在菊苣化感物质的处理条件下，甜菜种子的发芽势、发芽率、发芽指数低于对照，而活力指数高于对照，说明菊苣化感物质虽然对甜菜种子的萌发抑制作用较强，但其反而促进了甜菜幼苗的株高，所以其活力指数的RI值转为正值。对甜菜种子萌发表现出促进作用的为秋葵、玉米、大豆化感物质，三种物质中，促进作用从大到小依次是大豆，秋葵，玉米，甜菜种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数均高于对照。

表1 不同化感物质对甜菜幼苗发芽率的影响

玉米和对照组的长势明显最好，大豆，秋葵的长势次之，菊苣，甜菜的长势最差，菊苣和甜菜化感物质的抑制作用很明显，根系的生长受到了严重的抑制，尤其是在甜菜化感物质的处理下的根系影响最大。

2.2 不同化感物质对甜菜生理指标的影响

如图1所示，随着幼苗的生长，鲜重均在一直增加。秋葵、玉米、大豆化感物质均对甜菜幼苗鲜重的增长有促进作用，其中玉米的促进作用最为明显，该结果与上述发芽实验结果保持一致，菊苣、甜菜化感物质抑制了幼苗根部的生长，进而抑制了其鲜重的增长。甜菜化感物质对自身仍有明显的抑制作用。

图1 不同化感物质对甜菜幼苗鲜重的影响

图2 不同化感物质对幼苗株高的影响

如图3可知，在不同化感物质的处理下，甜菜红素含量呈现出不同的表现。在秋葵、菊苣、甜菜、大豆化感物质的处理下，色素含量在最初的子叶时期稳步增加直到四叶期，之后增速变慢，甚至甜菜化感物质下的色素含量出现了小幅的下降。玉米化感物质下，幼苗在初期表现出了最高的色素含量，之后开始下降，直到四叶期，四叶期到六叶期后开始趋于平稳。

图3 不同化感物质对甜菜幼苗甜菜红素含量的影响

说明经过处理后的幼苗甜菜红素含量均明显高于对照组，表明虽然甜菜化感物质对自身的发芽率及长势有负面影响，但其化感物质也促进了甜菜红素的合成，可以对各个处理组的化感物质进行进一步的分离、纯化等，找到具体原因，从而对甜菜红素生物合成途径进行进一步的了解[9]。此外，我们可以发现，甜菜幼苗的四叶期均是一个转折点，色素含量到四叶期后均会趋于平稳。

2.3 不同光质对甜菜生理指标的影响

如图4，可以得到，绿光、蓝光、红光均会对幼苗的生长产生抑制作用，红光的抑制作用最为明显，鲜重的变化幅度极小，几乎生长停滞。绿光和蓝光相比，抑制作用差别不大，绿光的抑制作用更强。储钟稀等人用自然光、红光和蓝光培养的黄瓜发现：3种光中，红光培养下的叶片红光下的叶片具有较高的光系统II(PS II)活性和较低的光系统I(PS I)活性，光合放O2速率最高，但植株生长得最慢；蓝光下的叶片具有较低的PS II活性和较高的PS I活性，放O2速率最低且叶绿素含量最低，但有利于植株生长，其株高和叶面积均比红光和自然光要高[10]。结果与本实验结果一致。

图4 不同光质对甜菜幼苗鲜重的影响

但是，经研究表明，不同光质对植物的影响效应不尽相同，甚至得出相反的结论。不能笼统地认为“某种光的光合作用强，某种光的光合作用弱”，有研究表明，大豆和玉米在自然光下生长得最快，红光次之，蓝光下生长的则最慢，说明光质对植物的影响与植物种类有关[11]。此外，研究表明，绿光会抑制气孔的张开，而蓝光和红光则表现出促进作用。每种光质对于植物生长的影响方面有较大的差异，研究表明，红光加快了光合产物的积累；蓝光可以有效促进叶绿体的发育，红、蓝、绿的三色复合光有利于叶面积的扩展。大多数的高等植物不同光质下的光合速率为橙、红光大于蓝紫光大于绿光[66]。因此光质对光合作用的影响机理是错综复杂的，要想彻底搞清楚这些问题还需要更进一步的深入研究。

如图5，可以得到，绿光、蓝光、红光均会对幼苗的生长产生抑制作用，红光的抑制作用最为明显，生长几乎停滞。绿光和蓝光相比，抑制作用差别不大，蓝光的抑制作用更强。

图5 不同光质对甜菜幼苗株高的影响

如图6，可以得到，绿光、蓝光、红光均会对幼苗的生长产生抑制作用，绿光和蓝光的抑制作用相当。红光的抑制作用最为明显，叶面积变化幅度极小，几乎无变化，叶面积的生长停滞，其引起的光合作用势必也无明显增长，该数据也为上述红光下鲜重及株高的生长停滞带来了合理的解释。

图6 不同光质对甜菜幼苗叶面积的影响

如图7，在不同的光处理下，色素含量的总体变化趋势均为先上升后下降，只是，红光照射下，下降的拐点在21 d，而蓝、绿、自然光下的幼苗色素下降是在28 d之后开始的。蓝光和自然光处理下色素含量较高，而绿光和红光下色素含量则明显偏低。其中蓝光处理中甜菜红素含量最高，红光中色素含量最低，蓝光处理下大概是红光下甜菜红素含量的5倍左右，这说明短波长有利于色素的积累。

图7 不同光质对甜菜幼苗色素含量的影响

分别为不同光质下播种了14日龄和28日龄时的甜菜幼苗。可以看到，红光下幼苗的生长状况明显差于其余三种光，且14日龄和28日龄时的幼苗变化幅度小。蓝光和绿光下的幼苗生长状况几乎相当，我们可以看到蓝光下的叶子呈长条形，而绿光下的幼苗叶片相比下更偏向于椭圆形，且随着时间的增长，蓝光和绿光下的幼苗长势与自然光差距越来越大，自然光下幼苗为四片真叶时，蓝光、绿光下的幼苗依然处在两片真叶期。