DCAMKL-1和p53对结直肠癌患者预后的影响

吴雪芳 李霜 杨迎春 涂贵兰 龙训 龙艳丽 陈祎 易韦

贵州省人民医院病理科（贵阳550002）

结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是一种常见的恶性肿瘤，发生率呈逐年增高趋势，虽化疗药物和化疗方案不断更新，但部分患者预后仍未得到明显改善。目前研究显示肿瘤干细胞在肿瘤发生发展过程中起了重要作用，且是肿瘤化疗耐药、复发的根源［1］。DCAMKL-1是近来发现的肿瘤干细胞的一种新型标志物，在多种肿瘤中表达，研究发现DCAMKL-1可表达于结直肠癌干细胞［2］，这类细胞具有高度的自我更新和增殖能力，参与结直肠癌的发生和耐药的产生。TP53基因作为一种非常经典和重要的抑癌基因在结直肠癌中经常发生突变，可促进结直肠癌的发生并参与耐药［3-4］，已得到广泛认可。本研究应用免疫组织化学技术检测DCAMKL-1和p53蛋白在癌旁正常黏膜（adjacent normal mucosa，ANM）、CRC组织中的表达，初步探讨两者与临床病理特征的关系，以及与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集贵州省人民医院2014年12月至2019年4月间手术切除并经病理确诊的126例结直肠癌及癌旁正常黏膜组织标本。患者术前均未经放化疗及生物治疗，男78例，女48例，年龄24～89岁，中位年龄57岁。所有标本均经两位病理医师分别诊断并进行肿瘤分化程度评估，其中包括高分化19例，中分化79例，低分化28例。根据美国癌症联合委员会（AJCC）第七版指南进行临床分期，Ⅰ期11例，Ⅱ期27例，Ⅲ期53例，Ⅳ期35例。

1.2 免疫组织化学按免疫组织化学SP法试剂盒说明书步骤进行，DCAMKL-1、p53抗体孵育前均经抗原高压热修复，用已知阳性表达的癌组织做阳性对照，PBS代替一抗作空白对照。所用抗体包括浓缩型兔抗人DCAMKL-1多克隆抗体（克隆号ab31704，美国Abcam公司，稀释浓度1∶100），浓缩型鼠抗人p53单克隆抗体（克隆号DO-7，北京中杉金桥生物有限公司，稀释浓度1∶100），SP染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 结果判读所有病理切片均由资深病理诊断医师判读。DCAMKL-1结果判读参照GAO等［5］的方法，DCAMKL-1蛋白的表达主要定位在细胞浆，评价综合2个独立的评分因素，染色面积0（＜5%）、1（5%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）和4（＞75%），染色强度（0=没有，1=轻微，2=温和，3=强）。将两种评分相乘，得到0、1、2、3、4、6、8、9、12分，当其值4时DCAMKL-1的免疫染色被认为是阳性表达；值为0～3时，免疫染色被认为是阴性表达。p53蛋白的表达主要定位于细胞核，以胞核中有棕褐色颗粒染色为阳性，结果判读参照OH等［6］和RACHMAWATI等［7］的方法，以阳性表达细胞数50%为强阳性，＜50%为弱阳性，0为阴性。

1.4 统计学方法应用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析。χ2检验比较不同组间表达率的差异，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线法、Log-rank检验及多因素Cox回归分析。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DCAMKL-1 和p53 蛋白在ANM 及CRC 组织中的表达情况DCAMKL-1在ANM组织中呈阴性表达，在CRC组织中阳性率为71.4%（90/126），主要定位于肿瘤细胞浆，呈显著的增高趋势（P ＜0.05）。p53定位于肿瘤细胞核，在ANM和CRC组织中阴性、弱阳性、强阳性表达率分别为92.1%（116/126）、7.9%（10/126）、0（0/126）和25.4%（32/126）、14.3%（18/126）、60.3%（76/126），CRC组织p53的强阳性表达率明显高于ANM（P ＜0.05）。见表1和图1、2。

表1 DCAMKL-1 和p53 蛋白在不同结直肠组织中的表达Tab.1 Expressions of DCAMKL-1 and p53 proteins in Colorectal tissue 例

图1 免疫组织化学法检测DCAMKL-1 蛋白在结直肠癌组织及癌旁正常黏膜组织中的表达（SP，×100）Fig.1 The expressions of DCAMKL-1 protein in CRC and ANM were detected by immunohistochemistry（SP，×100）

图2 免疫组织化学法检测p53 蛋白在结直肠癌组织及癌旁正常黏膜组织中的表达（SP，×200）Fig.2 The expressions of p53 protein in CRC and ANM were detected by immunohistochemistry（SP，×200）

2.2 DCAMKL-1 及p53 蛋白的表达与CRC 患 者临床病理特征的关系DCAMKL-1在CRC患者年龄、性别、临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移上的差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。p53在CRC患者年龄、性别、肿瘤分化程度上的差异均无统计学意义（均P ＞0.05），而p53的表达在肿瘤临床分期、淋巴结转移上差异有统计学意义（P = 0.048、0.007）。见表2。

表2 结直肠癌组织中DCAMKL-1 和p53 蛋白的表达Tab.2 Expressions of DCAMKL-1 and p53 proteins in colorectal carcinoma tissues 例

2.3 DCAMKL-1、p53 蛋白的表达与CRC 患者生存预后的关系随访截至2019年9月，有随访资料96例，随访率76.2%，随访时间6～53个月，死亡14例（14.6%），存活82例（85.4%），Kaplan-Meier生存分析显示1年生存率93.6%，2年生存率85.5%，3年生存率83.9%。对性别、年龄（分为＞65岁组与65岁组）、肿瘤分化程度（分为高分化组、中分化组与低分化组）、临床分期（分为Ⅰ+Ⅱ组与Ⅲ+Ⅳ组）及DCAMKL-1表达（分为阴性组与阳性组），p53（分为弱阳性组、阴性/强阳性组）蛋白表达情况分别进行Kaplan-Meier生存分析，发现临床分期与预后明显相关，Ⅰ+Ⅱ期的患者预后明显好于Ⅲ+Ⅳ期的患者，且两者之间差异具有统计学意义（P=0.004，3年总体生存率：100%vs.75.3%）；肿瘤分化程度总生存率差异虽然不明显，但高分化组生存率高于中、低分化组。DCAMKL-1与p53蛋白的表达水平对患者的预后无影响（P ＞0.05）。将年龄、性别、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移、DCAMKL-1和p53蛋白表达情况引入Cox模型进行多因素分析，结果显示，临床分期是影响结直肠癌患者术后的独立预后因素（HR = 6.364，P =0.001）。见图3和表3。

图3 结直肠癌患者的Kaplan-Meier 生存曲线Fig.3 Kaplan-Meier curves of patients with colorectal carcinoma

表3 CRC 患者多因素COX 回归分析Tab.3 Multivariate COX regression analysis of CRC patients

3 讨论

DCAMKL-1基因位于第13号染色体长臂（13q13），是在有丝分裂后的神经元中发现的一种跨膜微管相关蛋白激酶，近年学者们发现它是一种特异性的胃肠道肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）标志物，存在于多种实体肿瘤中，包括胰腺、前列腺、结肠和肝细胞癌等［2］。MAY等［8］研究发现将DCAMKL-1阳性细胞注射到裸鼠，能够形成腺样结构和所有肠细胞系，这说明DCAMKL-1阳性细胞具有多能性，进一步有力地证明了DCAMKL-1阳性细胞可能为干细胞。NAKANISHI等［2］发现患有大肠癌的实验鼠，含有DCAMKL-1蛋白的细胞会在较长一段时间内持续产生肿瘤细胞，通过基因操作，有选择地清除含这种蛋白质的细胞，实验鼠体内的大肠癌组织面积缩小了80%以上，有些甚至完全消失，而且未发现副作用，以此标志为目标，可实现对肿瘤干细胞的精准攻击，有望用来研发几乎没有副作用的抗癌药物。SHI等［9］分析发现DCAMKL-1可能是恶性肿瘤发展的危险因素，并可能成为恶性肿瘤的有前景的诊断和预后生物标志物。本研究结果显示CRC组织中DCAMKL-1蛋白表达较ANM显著增高，从组织学层面证明了DCAMKL-1蛋白的表达与CRC的发生密切相关，提示DCAMKL-1蛋白的检测对CRC的早期诊断可能有一定的帮助。

人野生型TP53基因编码一种核蛋白，它是一种应激反应蛋白，该蛋白可诱导细胞周期阻滞、凋亡、细胞衰老和分化，以响应内源性和外源性应激信号，可通过调节基因转录来应对癌基因信号激活以及DNA损伤等不利因素［10］。由于野生型p53蛋白半衰期短，细胞内含量低，因此难以检测到［11］。但当TP53基因突变后，其编码的p53蛋白半衰期较长，稳定性强，在核内不断积累，失去了对细胞的监视作用，从而在细胞恶变中起着癌基因的作用［12］。TP53基因是一种非常经典和重要的抑癌基因，在多种肿瘤中发生突变，结直肠癌TP53基因突变常见［13］。XI等［14］研究显示，正常结直肠黏膜上皮p53表达阴性，随着肠腺上皮不典型增生的出现p53阳性表达随之增高，且在CRC中表达最高，表明p53表达上调在结直肠正常黏膜经腺瘤向癌发展过程中起着重要作用。本研究也发现在ANM中p53绝大部分均为阴性，CRC组织中p53阳性表达率明显高于ANM，与文献报道一致［15-16］。因此，检测p53表达情况有利于预测早期癌变的发生及临床早期诊断。既往大量研究认为在大多数肿瘤中TP53发生突变，免疫组化p53蛋白是高表达的，因此学者们在研究p53蛋白在CRC组织表达情况时多采用2层分组方式（阴性/阳性）。随着分子生物学技术的发展及对TP53基因的深入研究，发现当CRC组织免疫组化p53蛋白表达阴性时，大多数肿瘤也出现了p53基因的突变，主要表现为无义突变或移码突变，提示采用2层分组方式有一定的缺陷性。OH等［6］学者为了探讨p53蛋白表达与TP53遗传状态的关系，将p53免疫组化结果与靶向外显子测序数据进行了对比，发现在CRC患者p53阴性表达组中53%发生错义突变或无义突变，在p53高表达组（50%肿瘤细胞阳性），约80%发生错义突变，而p53低表达组（＜50%肿瘤细胞阳性），超过70%的CRC患者没有发生TP53基因突变，这说明p53低表达组的CRC更有可能代表野生型TP53的CRC。因此本研究将p53表达分为阴性组、弱阳性组（＜50%肿瘤细胞阳性）、强阳性组（50%肿瘤细胞阳性），进一步将这3组分为野生型组（弱阳性组）、突变型组（阴性/强阳性组）。虽然按p53免疫反应程度来评估TP53基因状态具有异质性及局限性，但参考OH等［6］及LOGULLO等［17］报道的p53表达与TP53基因型状态具有显著相关性，提示这种分组方式具有较好的可行性，且本研究最初也采用了2层分组方式（阴性组/阳性组），未发现p53与病理临床特征的关系，而采用3层分组方式（阴性组/弱阳性组/强阳性组）时，发现p53突变型组（阴性/强阳性）与临床分期、淋巴结转移有密切关系，差异有统计学意义，提示p53蛋白处于突变型表达模式（阴性/强阳性）时，肿瘤的侵袭转移能力增强［18-19］。综合分析本研究认为采用3层分组方式优于2层分组，且这种3层分组方式可以较好的运用于临床病理诊断判读中，有助于预估临床分期和患者预后情况。

本研究对96例CRC患者的随访结果进行了生存分析，发现临床分期Ⅲ+Ⅳ组生存率曲线低于Ⅰ+Ⅱ组，提示临床分期是影响CRC患者生存时间的风险因素。同时本研究还发现肿瘤分化程度高分化组的生存率高于中、低分化组。文献报道DCAMKL-1蛋白与CRC患者预后相关［20］，本研究暂未发现该相关性，可能是因本研究样本量较少、纳入对象种群不同等多种因素影响，可增加样本量进一步分析探讨。OH等［6］报道在辅助化疗的Ⅲ期和高危Ⅱ期CRC患者中，p53表达状态是一个独立的预后标志物。本研究未发现p53蛋白表达对CRC患者生存时间有影响，这可能是由纳入研究的对象临床分期等因素不同引起。进一步的多因素分析显示，临床分期是影响CRC患者的独立预后因素，提示对CRC患者的预后评估具有较高的价值。

本研究通过免疫组织化学法检测CRC、ANM组织中DCAMKL-1、p53的表达，结果表明CRC组DCAMKL-1、p53明 显 高 表 达 于ANM组，推 测DCAMKL-1、p53在CRC的发生中起到一定调控作用。p53与CRC的临床分期和淋巴结转移有关，且临床分期是影响CRC患者预后的独立因素。