血清CD26在糖尿病合并结直肠腺瘤-腺癌序列中的表达及其意义

王亚丹，葛 将，黄树峰，吴 静

1.首都医科大学附属北京世纪坛医院消化内科，北京 100038； 2.大庆市人民医院肿瘤三科； 3.首都医科大学附属北京友谊医院消化科，国家消化系统疾病临床医学研究中心，北京市消化疾病中心，消化疾病癌前病变北京市重点实验室

根据2018年世界癌症报告，在世界范围内结直肠癌(colorectal cancer，CRC)发病率位于所有癌症第三位(10.2%)，死亡率位于所有癌症第二位(9.2%)[1]。目前研究认为，大多数情况下CRC的发生、发展要经过一个腺瘤的形成过程，其演变需10～15年。结直肠腺瘤、结直肠腺癌早期筛查和诊断对于降低CRC发病率和死亡率至关重要，但早期结直肠腺瘤、结直肠腺癌往往无明显症状。内镜检查对于早期发现并摘除大肠腺瘤、早期癌变，控制和降低大肠癌发病率有着不可忽视的现实意义。但内镜检查属有创检查，检查前的肠道准备及操作过程均存在一定风险，尚不能被广泛接受和认可。便潜血检查是无创的筛查手段，但灵敏性及特异性均较低。针对结直肠腺瘤及腺癌高发人群或有消化道症状人群，亟需一种可预测腺瘤、腺癌发生的血清学检查指标。目前癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是最常用的结直肠肿瘤标志物，但其在无症状CRC患者中的敏感性及特异性均较低，限制了其在筛查中的应用[2]。近年来还发现透明质酸介导运动的受体(receptor for hyaluronan-mediated motility,RHAMM)、叉状头转录因子(FOXP3+)、Treg、热休克蛋白27(heat shock protein,HSP27)、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α(phosphoinositide 3 kinase catalytic alphapoly petide,PIK3CA)、磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen,PTEN)等对判断CRC的预后具有一定的意义[3]，但均未能应用于临床检测。目前国内外已有多项糖尿病与癌症的相关性研究，研究表明糖尿病可增加多种肿瘤的发病风险，多项大规模前瞻性队列研究均显示糖尿病增加CRC的发病及死亡风险[4-6]。CD26也称二肽基肽酶Ⅳ(DDP-4)，是体内外促使胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)降解、失活的关键酶之一，影响GLP-1的血糖调节功能[7]。另外有研究提示，CD26与CRC及多种肿瘤的发生、发展相关[8]，同时其蛋白酶活性也与糖尿病相关，本文拟研究血清CD26浓度是否在糖尿病合并结直肠腺瘤及腺癌患者中存在差异，并与CEA相比较，初步探讨其作为肿瘤标志物的可能。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象：收集2012年1月至2013年12月于首都医科大学附属北京世纪坛医院消化内科住院并行结肠镜及病理检查明确诊断为结直肠腺癌的患者66例，中位年龄66岁(54～78岁)，其中26例合并糖尿病；结直肠腺瘤患者68例，中位年龄59岁(47～71岁)，其中28例合并糖尿病；经结肠镜检查无腺瘤或癌的正常对照者80例，中位年龄59岁(48～70岁)，其中40例合并糖尿病。

1.1.2 排除标准：(1)明确的非息肉性肠道疾病，如溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠结核等；(2)合并感染性疾病、严重心血管疾病、免疫系统疾病、肝肾功能异常的患者；(3)患有除CRC外其他系统肿瘤的患者；(4)有家族性腺瘤性息肉的患者；(5)1型糖尿病患者；(6)各种原因导致的患者资料缺失，数据不能正常分析者。

1.1.3 主要试剂：Human dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP4/CD26 ELISA Kit[美国Rapidbio(RB)公司]。

1.2 方法

1.2.1 血清CD26检测：运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测入组患者血清中CD26水平。用纯化的人CD26抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入CD26，再与HRP标记的CD26抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CD26含量呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值(OD值)，通过标准曲线计算样品中人CD26浓度。

1.2.2 血清CEA检测：血清CEA检测由北京世纪坛医院检验科生化实验室采用电化学发光法统一检测，试剂由罗氏公司生产(批号:10224FN00)。

2 结果

2.1 各组间年龄情况相比经统计分析，各组间有糖尿病患者与无糖尿病患者年龄相比，差异均无统计学意义(P>0.05);不同病理组间年龄差异有统计学意义(P<0.05)，结直肠腺癌组年龄高于其他两组(见表1)。

表1 各组患者年龄比较Tab 1 Comparison of age of patients in each group

2.2 性别对血清CD26、CEA水平的影响各组内不同性别间CD26、CEA水平相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)，说明血清CD26、CEA水平与性别无关。

2.3 不同病理分组CD26、CEA水平比较本研究结果显示，从正常到腺瘤、腺癌，血清CD26水平呈逐渐升高趋势，正常对照组与结直肠腺瘤组比较，差异有统计学意义(P<0.001)，结直肠腺瘤组与结直肠腺癌组比较，差异有统计学意义(P=0.002)。从正常到腺瘤、腺癌，血清CEA水平也呈逐渐升高趋势，但正常对照组与结直肠腺瘤组差异无统计学意义(P=0.160)，结直肠腺瘤组与结直肠腺癌组差异有统计学意义(P<0.001)，从腺瘤到腺癌，CEA水平骤增(见表3、图1～2)。

表2 各组内不同性别间CD26、CEA水平比较Tab 2 Comparison of CD26 and CEA levels between different genders in each group ng/ml)

表3 不同病理分组CD26、CEA水平Tab 3 Comparison of CD26 and CEA levels in different pathological groups ng/ml)

2.4 糖尿病对血清CD26水平的影响对于合并糖尿病的患者，正常对照组、结直肠腺瘤组、结直肠腺癌组中血清CD26水平呈逐渐升高趋势，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。相同病理分组，合并糖尿病与非糖尿病患者间血清CD26水平相比，正常对照组及结直肠腺瘤组差异均无统计学意义(P=0.370，P=0.774)，但结直肠腺癌组间差异有统计学意义(P=0.014)，提示糖尿病不影响正常及结直肠腺瘤患者血清CD26水平。合并糖尿病的结直肠腺癌患者，血清CD26水平高于非糖尿病结直肠腺癌患者(见表4、图3)。

注：与正常对照组比较，#P<0.01;与结直肠腺瘤组比较，*P<0.01。

表4 各组间CD26水平比较Tab 4 Comparison of CD26 levels of each group ng/ml)

2.5 糖尿病对血清CEA水平的影响对于合并糖尿病的患者，正常对照组、结直肠腺瘤组、结直肠腺癌组中血清CEA水平逐渐升高，但正常对照组与结直肠腺瘤组间比较，差异无统计学意义(P=0.450)，正常对照组与结直肠腺癌组间、结直肠腺瘤组与结直肠腺癌组间差异有统计学意义(P<0.05)。相同病理分组，合并糖尿病与非糖尿病患者间血清CEA水平相比，正常对照组及结直肠腺瘤组差异均无统计学意义(P=0.900，P=0.404)，结直肠腺癌组间差异有统计学意义(P=0.022)，提示糖尿病不影响正常及结直肠腺瘤患者血清CEA水平，合并糖尿病的结直肠腺癌患者，血清CEA水平高于非糖尿病结直肠腺癌患者(见表4、图4)。

注：与结直肠腺癌非糖尿病患者相比，*P<0.05。

3 讨论

CRC是常见的恶性肿瘤，也是危害人类健康的主要疾病之一，全世界每年新发病例约120万例。近年美国CRC的发生率及死亡率呈缓慢下降趋势，可能归功于CRC的监测及早期腺瘤的切除[9]。随着人民生活水平的提高，我国CRC发病率呈逐年升高趋势。目前CRC的主要治疗手段包括手术、放疗、化疗、生物免疫治疗等，其5年生存率始终徘徊在50%左右，而只有早期切除的患者才能获得较高的5年生存率。

CRC的发生、发展是一个复杂的过程，涉及的致病机制和因子包括环境和饮食因素，以及遗传突变和体细胞突变等。早在1978年Morson 等发现部分大肠癌病灶中有残留的腺瘤组织存在，并且随着肿瘤的逐渐进展，残留的腺瘤组织逐渐减少[10]，故而提出大肠癌是由大肠腺瘤演变而来。目前多项研究表明，结肠癌的发生、发展是一个多阶段的、涉及多基因改变的逐渐积累的复杂过程，通常由“正常肠上皮-早期腺瘤-晚期腺瘤-癌-远处转移”逐渐演变。在肿瘤发生的不同阶段均鉴定出特异的癌基因活化和抑癌基因失活，如K-Ras、P53突变[11]等。这一癌变过程需5年以上。有研究提示，空腹血浆胰岛素水平升高[12]和胰岛素样生长因子-1是结直肠腺瘤的危险因素[13]。Inoue等[14]完成的Meta分析显示，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者CRC发病危险性显著增加(RR=1.61，95%CI：1.18～1.35)。日本的一项大规模队列研究也显示，糖尿病患者发生CRC的风险比非糖尿病患者增加1.36倍[15]。结直肠腺瘤、腺癌中2型糖尿病的患病率高于普通人群[16]。伴发糖尿病的结直肠腺瘤性息肉更易复发[17]。目前认为糖尿病对CRC发病及预后的影响可能与长期高血糖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、胰岛素-IGF-1轴、基因等相关，但其具体机制目前仍不明确。CD26具有蛋白酶活性，是体内外主要促使GLP-1降解、失活的关键酶之一，迅速裂解、失活内源性GLP-1，导致其半衰期极短(<2 min)[7]，从而影响其血糖调节功能。有研究表明，CRC患者血清CD26水平高于正常，术后1个月降低[术前(620.0±86.2)μg/L，正常组(517.7±92.3)μg/L，P<0.05；术后1个月(507.4±80.4)μg/L，与术前相比，差异有统计学意义，P<0.05][8]。与de la Haba Rodríguez等的报道[17]结果相似。研究进一步探讨了大肠癌患者血清CD26水平与Dukes分期的关系，发现大肠癌患者血清CD26水平随着Dukes分期的升高而增加，单因素方差分析显示差异有统计学意义[18]。这些研究均提示检测血清CD26是一种无创、灵敏度较高的检测方法，可与粪便潜血及其他肿瘤标志物联合检测用于CRC的诊断。但这些研究均未将糖尿病作为CRC的独立危险因素进行分析，本研究在这方面进行了初步探索。本研究结直肠腺癌组年龄高于结直肠腺瘤组和正常对照组，与其他研究一致[9]。本研究统计显示，从内镜阴性到腺瘤、腺癌，血清CD26和CEA浓度均呈逐渐升高趋势。同时正常对照组与结直肠腺瘤组间比较，血清CD26差异有统计学意义，而血清CEA差异无统计学意义；正常对照组与结直肠腺癌组间血清CD26及CEA相比，差异均有统计学意义。结直肠腺瘤形成过程中即有血清CD26的升高，并在癌变后进一步升高，而血清CEA仅在癌变后升高，提示血清CD26的升高为CRC形成过程中的早期事件，有成为CRC早期诊断的参考标志物可能。但本研究入组病例有限，如行肿瘤分期研究病例数相对不足，缺乏可信度，可待进一步增加病例数后进一步研究非高危腺瘤、高危腺瘤、早期癌变及肿瘤各期间血清CD26水平的变化。是否合并糖尿病对正常对照组和结直肠腺瘤组患者血清CD26、CEA水平均无影响，结直肠腺癌合并糖尿病患者的血清CD26、CEA水平高于非糖尿病患者。同时无论是否合并糖尿病，结直肠腺癌患者血清CD26、CEA水平均高于正常对照组及结直肠腺瘤组。提示糖尿病合并腺癌患者血清CD26、CEA的升高同时受到肿瘤及糖尿病的双重影响。其内在机制暂不明确，但提示糖尿病合并腺癌患者可作为一特殊人群进一步研究分析。

总之，本研究发现，血清CD26水平从内镜阴性到腺瘤再到腺癌逐渐升高。糖尿病合并结直肠腺癌患者血清CD26及CEA均高于非糖尿病结直肠腺癌患者。糖尿病患者进行血清CD26、CEA检测，较非糖尿病患者更具诊断价值。CD26检测有望提高CRC早期诊断率。