基于自噬相关的PI3K-AKT-mTOR通路研究益气化瘀方对心肌缺血再灌注损伤的改善作用

2020-12-08黄国强李雪山

世界最新医学信息文摘 2020年78期

黄国强，李雪山

(中山市中医院，广东中山)

0 引言

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)属临床常见心肌损伤症状，心肌损伤会造成心肌细胞坏死和凋亡[1]。因此，本研究推测益气化瘀方可能通过影响PI3K-AKT-mTOR通路实现对MIRI自噬的影响，建立MIRI模型，探讨益气化瘀方对MIRI的保护作用及初步探究其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar雄性SPF级大鼠。

1.2 试剂与方法

益气化瘀方组成：丹参20 g，仙鹤草、五爪龙各15 g，田七、红景天各10 g，上述煎煮2次，浓缩成每毫升0.6g生药。雷帕霉素；亲和素-生物素-过氧化物酶复合物染色；免疫组化试剂盒；一抗兔抗鼠哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3、PI3K及其磷酸化水平、AKT及其磷酸化水平、mTOR、β-actin。

1.3 研究方法

1.3.1 模型建立及药物处理

实验前大鼠禁食过夜，参考文献[2]方法建立MIRI模型，腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后固定于实验台上，气管插管，接小动物呼吸机机械通气。逐层拨开胸廓，露出心脏，分离右侧颈总动脉，将心导管经右侧颈动脉插入左心室，以监测左心室压力。沿胸骨左缘2-3 mm处行切口，逐层分离处胸肌后，于第4肋间夹闭肋间血管，剪断肋骨，充分暴露左心耳及左心室。小心撕开心包，在左心耳下缘2 mm处，以无创小圆针带6-0丝线进针穿过冠状动脉左降支下方的心肌表层，将缝线两端引出硅胶套管(硅胶套管一端紧贴左心室壁)，收紧结扎线，检测大鼠心电图(electrocardiogram，ECG)，以ECG ST段明显抬高为结扎成功的标志。持续缺血30 min，松开结扎线，使缺血心肌再灌注2 h，ECG出现病理性Q波，ST段至正常水平，心肌灌注成功。模型成功后随机分为模型组、益气化瘀方组、自噬激动剂组，每组12只。假手术组仅打开胸腔暴露出心脏穿丝线而不结扎。所有动物每天腹腔注射50000 U/d青霉素防止感染。

益气化瘀方组每天灌胃15.9 g/kg益气化瘀方[3]，自噬激动剂组每天灌胃5 mg/kg雷帕霉素[4]，假手术组和模型组每天灌胃等体积的生理盐水，连续10 d。

1.3.2 TTC染色检测心肌梗死体积

实验结束后迅速摘除大鼠心脏，预冷PBS中清洗，置于-20℃冰箱中冷冻25 min。平行于心室将心脏横切成5片，于1% TTC磷酸缓冲液中37℃孵育20 min，10%甲醛室温固定1 h。拍照并用Image-J软件分析梗死百分比。其中正常心肌呈红色，梗死区呈白色，每组4只。

1.3.3 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色观察大鼠心肌组织病理学变化情况

每组剩余大鼠8只，迅速摘除大鼠心脏，部分置于4%多聚甲醛中固定，固定后制备石蜡切片；部分采用戊二醛-锇酸双重固定法固定，超薄切片机切片；部分置于-80℃冰箱中保存待检。

每组取出部分心肌组织石蜡切片，使用HE染色试剂盒对心肌组织进行染色，中性树脂封片，显微镜拍照观察心肌组织病理学变化情况。

1.3.4 电镜观察大鼠心肌细胞超微结构情况

每组取超薄切片，醋酸双氧铀-枸橼酸铅双重染色，透射电镜对心肌细胞超微结构拍照。

1.3.5 免疫组化检测心肌组织中自噬蛋白LC3蛋白情况

每组取出部分心肌组织石蜡切片，经二甲苯、梯度酒精浸泡后，使用ABC免疫组化试剂盒对LC3(1：200)进行染色，具体操作步骤按说明书进行。

1.3.6 免疫印迹法检测心肌组织中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白表达情况

从-80℃冰箱中取出心肌组织，RIPA裂解液裂解组织，提取总蛋白，上样20μg，PVDF转膜后封闭，一抗PI3K(1：1000)、p-PI3K(1：1000)、AKT(1：1000)、p-AKT(1：1000)、mTOR(1：2000)、β-actin(1：10000)4℃孵育过夜，加入对应二抗，ECL化学发光液显色、Image-J软件定量扫描蛋白条带灰度值，蛋白相对表达水平=目标蛋白灰度值/内参β-actin蛋白灰度值。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 24.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)描述，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建模大鼠不同时段ECG

结扎前，ECG正常；结扎30 min后大鼠ECG ST段明显抬高；松开结扎线2 h，ECG可见病理性Q波，ST段下降至正常水平，心肌再灌注成功。见图1a、b、c。

2.2 益气化瘀方对大鼠心肌梗死影响

与假手术组相比，模型组心肌梗死体积升高(P＜0.05)；与模型组相比，益气化瘀方组、自噬激动剂组心肌梗死体积降低(P＜0.05)。见图2、表1。

图1 建模大鼠不同时间心电图

图2 4组大鼠心肌梗死体积情况

图3 4组大鼠心肌组织病理情况(200×)

图4 4组大鼠心肌细胞超微结构情况(8000×)

图5 4组大鼠心肌组织自噬蛋白LC3水平(200×)

表1 4组大鼠心肌梗死体积比较(±s，n=4)

注：与假手术组相比，#P＜0.05；与模型组相比，*P＜0.05。

2.3 益气化瘀方对大鼠心肌组织形态影响

假手术组心肌细胞形态正常，排列规则；模型组心肌细胞排列紊乱，肥大现象明显，呈现坏死现象，炎症浸润明显；益气化瘀方组心肌细胞得到改善、逐渐恢复，细胞损伤减轻；自噬激动剂组心肌细胞形态虽有所减轻，但症状不明显，细胞肥大、坏死现象存在，炎症有所减轻。见图3。

2.4 益气化瘀方对大鼠心肌组织超微结构影响

假手术组心肌细胞、心肌纤维排列整齐，肌小结完整，线粒体完整；模型组心肌细胞排列紊乱、不紧密，心肌纤维断裂、溶解、紊乱，肌小结破坏，线粒体损伤；益气化瘀方组与假手术组相似，心肌细胞、心肌纤维排列较整齐，肌小结较完整，线粒体完整；自噬激动剂组状况介于模型组和益气化瘀方组之间，心肌细胞、心肌纤维排列整齐，肌小结破坏现象得到改善，线粒体出现损伤但程度小。见图4。

2.5 益气化瘀方对大鼠心肌组织自噬蛋白LC3影响

与假手术组相比，模型组心肌组织中LC3阳性细胞比例降低(P＜0.05)；与模型组相比，益气化瘀方组、自噬激动剂组心肌组织中LC3阳性细胞比例升高(P＜0.05)。见图5、表2。

表2 4组大鼠心肌组织中LC3阳性细胞比例比较(±s，n=8)

注：与假手术组相比，#P＜0.05；与模型组相比，*P＜0.05。

2.6 益气化瘀方对大鼠心肌组织PI3K-AKT-mTOR通路蛋白影响

4组心肌组织中PI3K、AKT蛋白差异无统计学意义(P＞0.05)。与假手术组相比，模型组心肌组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平升高(P＜0.05)；与模型组相比，益气化瘀方组、自噬激动剂组心脏组织中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平降低(P＜0.05)。见图6、表3。