雌激素作用下神经干细胞移植治疗创伤性脑损伤的研究进展

梁雨婷 胡悦 赵安琪 王沐榕 孙建 李力卓

以往大量研究表明，雌激素可以发挥与生殖系统、非生殖系统相关的生理作用，在机体生长发育过程中参与激活、形成神经通路以及构建中枢神经系统网络，同时雌激素也可对神经系统内细胞程序性死亡等方面进行调节[1]。人类主要的雌激素是17β-雌二醇（17β-estradiol，E2），卵巢内胆固醇是合成雌激素的主要前体。而在大脑内，雌激素是雄激素经芳香酶的作用转变合成的，同时雌激素也可经神经细胞自身合成。这些局部合成的雌激素对神经元和突触的形成发挥着极为重要的作用，同时对神经干细胞（neural stem cells，NSCs）分化成为神经元也有重要的调控作用。目前，关于NSCs 移植治疗创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）的研究已有一定的进展和发现，为临床实施TBI 治疗手段和途径的创新提供了良好的开端。本文将从雌激素对NSCs 的控制作用、雌激素对NSCs 分化方向的调控作用、NSCs 移植治疗TBI 的临床应用以及雌激素治疗TBI 的临床应用等方面展开综述。

一、雌激素对NSCs 的控制作用

（一）雌激素作用下NSCs 可发育为神经元

NSCs 是一类具有多向分化潜能并且能够自我更新、无限增殖的细胞。E2 影响神经细胞的生长和分化、各级突触的形成及相关激素和神经递质受体的合成，从而导致中枢神经系统结构的永久性改变[2]。NSCs 在E2 的作用下可分化为神经元[3]。E2 主要通过与雌激素受体（estrogen receptors，ERs）的结合对NSCs 发挥其生物学效应。ERs 包括α 亚型和β 亚型，这2 种受体亚型在脑内的分布具有脑区特异性[4,5]。相关研究发现，E2 主要通过与ERβ 结合促进人类神经前体细胞的增殖，E2 与ERβ 结合后诱导ERβ 激活，经pERK 信号通路触发细胞内DNA 复制、细胞中心体扩增使前体细胞增殖[6]。此外，ERβ 的激活启动DNA、中心体复制，使细胞周期进入S 期和DNA 分离。同时E2 还可促进海马NSCs 增殖，当其浓度为10-8mol/L 时，细胞增殖的数量最多，E2 浓度逐渐增加后，在细胞增殖过程中，NSCs 可同时表达ERα 和ERβ[7]。据此推断，E2 在促进NSCs 增殖、分裂分化为神经元的过程中是通过ERα 与ERβ 结合后同时发挥作用的，即E2 与ERα 和ERβ 结合形成的激素-受体复合物激活受体DNA 上特异的激素反应元件，互相作用后调节靶基因的表达。除此之外，还可通过非基因组机制，如E2 通过与G 蛋白相偶联的膜通道受体等发挥生理效应[8]。

（二）雌激素作用下NSCs 分化后的神经元突触增加

给予去势的雌性大鼠定量E2 后，海马CA1 区锥状神经元的兴奋性树突密度增加，且在新生的兴奋性树突上有新突触形成，新生突触长度变短而分枝数目增加[9]。Murphy 和Glanzman[10]的研究结果证实，E2 诱导兴奋性树突上的新突触形成可被N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体阻断剂阻断。侧面说明E2 使海马CA1 区NMDA 受体密度增加可能是形成海马CA1 区内兴奋性突触的重要条件之一。各种损伤后的轴突和突触再建可促进损伤后的神经修复，使神经系统功能得到充分改善。突触素（synaptophysin，SYP） 是一种位于突触前囊泡上与突触结构和功能密切相关的钙结合蛋白，其几乎存在于外周和中枢神经系统的所有神经末梢上，参与发生突触、释放神经递质以及导入、转运、再循环利用突触囊泡[11]。雌激素可间接影响SYP 进而使突触发生和形成，是突触结构与功能完整的重要生化物质基础。近年研究发现，小剂量的E2 可上调树突的肌动蛋白F-actin，控制与神经元树突形态、结构、运动密切相关的上游调控因子，使树突的长度、密度和运动性增加，同时NMDA 受体磷酸化增加；E2 较长时间的积累抑制突触发生的同时可抑制神经元树突的密度，使树突上突触密度减小[12]。由此推断，小剂量的E2 在促进NSCs 增殖、分裂、分化为神经元后，树突的长度、密度、运动性增加，同时可减轻突触受损、促进突触重建，而大剂量或长时间的E2 累积可抑制树突和突触发育，继而神经元受损，影响动物大脑的发育过程，神经系统功能恶化导致成年后记忆、认知、感觉等行为的异常。虽然在E2 的作用下决定NSCs 分化结果的分子机制尚未彻底研究透彻，但可以肯定的是，多种特异性的受体及生长因子之间的互相作用决定了NSCs 的分化结果[13]。同时，E2 控制NSCs 的增殖、分化，在大鼠的整个神经系统发育过程中起着不可比拟的作用。

二、雌激素对NSCs 分化方向的调控作用

（一）雌激素对5-羟色胺能神经元的作用

E2 主要通过与ERs 结合对5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神经元发挥作用[14]。相关研究表明，NSCs 在一定条件下可被定向诱导分化为5-HT 能神经元，并且同时表达ERα和ERβ[15]。目前普遍认为，ERα 主要在海马回介导，而ERβ则在基底前脑、中缝背核高浓度分布。Gundlah 等[16]对去势恒河猴的研究结果发现，ERβ mRNA 中缝背核5-HT 能神经元表达ERβ mRNA 的同时可被翻译成相应的蛋白，而且不论是ERβ mRNA 还是ERβ 蛋白表达，有或无E2，治疗组都表现出极其相似的表达浓度，因此介导恒定表达的ERβ 受体促使细胞核内某些基因的转录如TPH、5-HT 受体基因等，继而受体基因转录后表达为有功能的蛋白质，从而影响5-HT能神经元神经递质的传递功能，可能是E2 对5-HT 能神经元的作用途径之一。

E2 也可作用于5-HT 受体，调节5-HT 能神经元的功能。5-HT 受体有许多不同的亚型，5-HT1A、5-HT2A 和5-HT2C 则是目前为止研究较多的5-HT 受体亚型。Lu 和Bethea[17]对去势恒河猴的E2 治疗组与空白对照组的治疗结果比较后发现，空白对照组位于中缝背核的5-HT1A 自身受体结合下调，同时位于下丘脑的神经元突触后5-HT1A 受体结合位点下调。激素替代治疗后的突触后5-HT2A 受体增多，而突触前5-HT1A 自身受体减少，因而促进5-HT 能神经元的功能，与5-HT 能神经元功能相关疾病的轻躁狂、激越、意识混乱、定向障碍等症状从而得到改善。

（二）雌激素对多巴胺能神经元的作用

一定条件下E2 可诱导NSCs 分化为多巴胺（dopamine，DA）能神经元，为NSCs 移植治疗帕金森病（Parkinson’s disease，PD）提供了理论基础[18]。相关研究发现，乙酰胆碱或γ-氨基丁酸可体外调节作用于DA 能神经元末梢的突触前膜，以此控制DA 的释放[19]。E2 也可直接影响纹状体乙酰胆碱和γ-氨基丁酸的活性，进而直接作用于DA 能神经元末梢，使DA 释放增加，PD 患者症状改善。

E2 不仅可调节DA 能神经元，还对其有神经保护作用。早在1977 年Bedard 等[20]提出E2 可作为神经保护剂抵抗纹状体DA 能神经元病变的观点。给予去卵巢雌鼠定量E2 后，可使应用神经毒性物质1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropy ridine，MPTP）导致的细胞死亡减少且纹状体DA 的含量减少得到改善。但是E2 的长时间应用最终会导致DA 能神经元耗竭、DA 释放减少以致症状加重。除此之外，正常雌鼠补充E2 后并不能使其免受MPTP 的神经毒性作用甚至神经系统功能紊乱[21]。由此可见，低水平的E2 可对DA 能神经元提供神经保护作用，而长时间的E2 使用并不能削弱MPTP 对纹状体DA 能神经元的细胞毒性作用。ERs 位于PD 患者DA 能神经元稀少的中脑中央灰质区，这一发现表明E2 可能在中脑中央灰质区为DA 能神经元提供神经保护作用。同时E2 可通过影响DA 转运物质减少神经毒性物质MPTP 重吸收，发挥神经保护作用，使DA 能神经元免受毒害甚至死亡[22]。E2 还可与神经营养因子协同作用而发挥其神经保护功能，同时作为抗氧化物质抵抗氧自由基的毒性作用[23]。总之，雌激素通过上述的诸多因素及环节促进了NSCs 向5-HT 能神经元、DA 能神经元的分化，为利用雌激素“润色”NSCs 移植治疗相关脑部疾病提供了有力证据。

三、NSCs 移植治疗TBI 的临床应用

（一）NSCs 移植类型的选取

自身NSCs 提取并经体外的细胞培养、扩增后进行移植具有较高的存活率，并且可避免移植后发生的免疫排斥反应。但自体NSCs 提取是有创的，会给机体带来巨大负担，加重脑损伤区域和周围水肿带细胞的损伤，严重的甚至会直接导致机体的死亡[24]。高速发展的克隆技术可解决这一问题带来的危害，但由于该技术操作过于繁杂、耗时过长、成本过高，且存在一定医学伦理的限制，因此目前难以得到广泛的普及和应用。异体的NSCs 移植目前研究较多，其优势包括：（1）异体NSCs 移植后可在机体内长期生存并分化为神经元，这一观点已在相关动物实验结果中得到证实[25]；（2）异体NSCs 移植也可直接参与神经再生作用或分泌型神经营养因子，促进其参与神经修复作用使受损的神经功能获得提升[26]；（3）异体NSCs 移植能改善机体运动功能的同时还能明显使其认知功能好转[27]。

目前异体NSCs 移植的一大问题是NSCs 在受损区域环境下的低生存率和保留率。除了受损区域的微环境直接被改善外也可在受损区域搭建一个适合NSCs 迁移及留存的新细胞骨架[28]。建立TBI 大鼠模型后，将NSCs 与透明质酸-胶原骨架中的bFGF 缓释系统（bFGF sustained release system,bFGFCRS） 共同移植到受损区域后发现，外源性NSCs 被bFGFCRS 作用后分化为神经元显著增高，并且新生神经元的突触与宿主脑组织原有的突触形成都增加。这些结果显示，bFGFCRS 的搭建为异体植入的NSCs 创造了良好的微环境，并且有利于神经组织的再生和机能恢复。使用HA-Lm 胶作为bFGF-CRS 的介质，观察到NSCs 在移植区域内的留存时间得到显著延长（＞3 d），且神经前体细胞向损伤区域周围的迁移率上升了20%[29]。

（二）移植部位和时间的选择

TBI 后脑组织可发生受损区域周围组织水肿、神经元死亡以及相关的炎症反应，尤其是小胶质细胞可在TBI 早期被诱导激活后发挥巨噬细胞样功能，产生相应细胞毒性效应，产生免疫调节因子和炎性介质对神经通路网络进行更改，促进损伤神经元凋亡、突触的剥离，继而影响神经修复性重组以及神经通路信息的传递[30,31]。虽然小胶质细胞的激活影响NSCs 移植后的迁移、存活、增殖以及分化，但与小胶质细胞相关的NSCs 也会调节其活动和功能，两者相辅相成、相互作用、相互影响[32]。促炎因子、炎性介质、兴奋毒性神经递质以及自由基在TBI 急性期（伤后3 h～3 d）大量释放，继而产生氧化应激反应及神经毒性作用，这些均可影响NSCs 移植的生存率和留存率[33]。Lee 等[34]将NSCs 移植到脑出血模型大鼠的受损区域后发现，超急性期（伤后3 h）移植NSCs 可减少早期受损区域神经元的凋亡、减少周围水肿带脑组织水肿的形成及炎性介质的浸润，这说明NSCs 具有抗炎和免疫调节作用。Shear 等[25]以CCI 动物模型为基础，将NSCs 立体定向移植到对侧皮质区或受伤侧纹状体，分别在伤后第2、7、14 天进行行为学的检测和评估，研究结果发现：（1）外伤后2～7 d 是最佳的移植时间；（2）移植到损伤区域邻近的大脑皮层或纹状体的NSCs 存活率和向损伤区域定向迁移的能力增强，大鼠的平衡运动系统也能得到部分改善。

（三）NSCs 移植治疗TBI 存在的问题

大量实验数据证实，NSCs 移植对治疗TBI 有一定成效，但其作用机制较为复杂，仍然需进一步的研究发现和探讨[35]。笔者认为，未来的研究应着重于以下几个问题与方向：（1）如何精确调控植入的NSCs 使其在脑内具有更高的存活率，并能精准地向损伤区迁移，定向分化以修复受损的神经组织，恢复脑功能；（2）探索最佳的NSCs 移植方式、移植时间、移植部位、移植数量以及移植后应持续的治疗以降低并发症的产生；（3）NSCs 移植后产生的致畸性、致瘤性、免疫排斥反应等相关并发症。

总之，NSCs 移植能从细胞水平上对受损的神经元、周围组织进行保护和修护，为TBI 的治疗提供了新的想法和新的思路。随着对NSCs 移植的深入研究，相信不久的将来就可以实现动物实验向临床治疗的转化，使其成为TBI 治疗的重要手段之一。

四、雌激素治疗TBI 的临床应用

目前大多数关于TBI 的研究表明动物的预后存在明显的性别差异，雌性动物的预后往往比雄性要好[36]。以往的研究表明，TBI 后动物创伤部位E2 的水平会增加，并且E2 的增加能够降低颅内压、减轻脑水肿、增加脑灌注压，最终使TBI后动物发生严重不良后果的几率大大降低[37]。由此可见，E2对于TBI 后具有明显的神经保护作用。

TBI 后机体免疫功能紊乱，同时会使机体对创伤的敏感性大大增加。TBI 导致的机体免疫失调过程是极其复杂的，包括TBI 后释放促炎因子与抗炎因子和抑制各种细胞介导的免疫应答[38]。Slowik 和Beyer[39]通过实验观察到E2 可通过ER作用于TBI 后小鼠创伤部位初始免疫细胞miRNA 上游的免疫监视序列，使其免疫监视功能增强。由此可见，E2 对TBI 后所导致的免疫失调发挥重要的调节作用。此外E2 还会发挥积极的抗炎作用，减轻TBI 后所导致的中枢炎性损伤。机体遭受TBI 时，促炎因子的过量释放导致脑水肿加重和神经元损伤[40]。虽然TBI 后所导致的炎症反应是病情加重的关键因素，但E2 对于TBI 后的炎症反应具有明显抑制作用。

目前的研究结果多数是基于动物实验而发现的，缺乏相关临床试验的研究。雌激素作为人体的一种生理激素，其含量也会随着女性生理周期及年龄增长而发生变化。因此雌激素对于创伤性颅脑损伤的疗效会存在个体差异化，在临床工作中应该根据患者具体病情及相关指标结合判断创伤性颅脑损伤的严重程度，制定个性化诊疗方案。

五、小结与展望

一定浓度的雌激素可促进NSCs 增殖并调控NSCs 的分化方向，使其分化成神经元。神经元数量增多，其兴奋性突触增加，可减轻突触受损、促进突触重建，恢复神经网络的沟通。小剂量的雌激素也可促进NSCs 分化为5-HT 能神经元和DA 能神经元，使其功能得到恢复和改善，发挥良好的神经保护作用使神经元免受凋亡。目前研究发现，建立TBI 大鼠模型后，NSCs 移植治疗后外源性NSCs 增殖、定向分化成为神经元对其有良好的神经修复作用。经雌激素预处理的NSCs移植或提早干预患者体内雌激素的浓度后NSCs 移植治疗TBI 也许可以发挥良好的临床效果，帮助患者提早恢复脑功能及认知、感觉、运动功能，减少并发症的产生，也为未来治疗TBI 的临床手术途径开创另一种可能性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突