TRPA1和TRPV4在牙龈瘤中的表达及意义

米会会 孙斌 陶林 沈亚峰 徐江

牙龈瘤来源于牙周膜及颌骨牙槽突的结缔组织，以牙龈增生为主要表现，切除后易复发。根据病理结构牙龈瘤常分为纤维性、肉芽肿性及血管性3类[1]。牙龈增生与牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)、上皮细胞及细胞外基质增多有关。钙离子阻滞剂(calcium channel bockers，CCB)作为常用降压药，随着我国高血压患病率的增高，服该类药物的患者增多，临床上钙拮抗剂诱导的牙龈增生已居药物性牙龈增生(drug-induced gingival overgrowth，DGO)首位[2]。CCB主要通过阻碍心肌和血管平滑肌钙离子的膜转运，抑制钙离子流入细胞内引起心肌收缩性降低和血管扩张，从而降低血压，而CCB如何引起牙龈增生，目前机制仍不明确。瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)通道参与许多细胞病理生理学变化，与牙龈增生有密切联系。TRPA1(瞬时受体电位通道A1)是非选择性能透过钙离子的通道，激活时主要引起钙离子内流，对氧化应激的多种产物、细菌毒素敏感[3]，与DGO硝苯地平[4]最相关。研究已证实HGFs表达TRPA1和TRPV1阳离子通道。TRPV4主要介导钙离子内流，已有研究表明TRPV4广泛表达于如神经、血管心脏和肾脏等组织[5]。本研究探讨TRPA1和TRPV4在牙龈瘤中的表达，并分析其与肿瘤临床病理参数的关系。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选取石河子大学第一附属医院2008 年6 月～2018 年6 月手术切除的牙龈瘤存档石蜡标本201 例。牙龈瘤均经病理确诊并分型。其中纤维性108 例，肉芽肿性55 例，血管性38 例。另选取48 例来自下颌第三磨牙埋伏阻生拔出术后的牙龈组织，经HE染色后阅片确诊，作为正常对照。实验组中，男87 例，女114 例，平均(45.18±15.16) 岁；对照组中，男22 例，女26 例，平均(38.03±13.16) 岁。2 组患者性别、年龄分布均无明显差异(P>0.05)。

服用硝苯地平的DGO组纳入标准[6]：①有高血压病史且服用硝苯地平时间大于半年；②伴有牙龈增生，上下颌前牙区严重；③需排除糖尿病等其他全身性疾病；④未同时服用苯妥英钠、环孢素A等其他引起牙龈增生的药物；⑤近半年未接受过牙周基础治疗；⑥手术前3 个月内无抗生素服用史。排除标准：①治疗期间换用非钙离子阻滞剂类降压药物者；②口服避孕药者；③由非钙诘抗类药物(如苯妥英钠、环胞菌素-A)引起的牙龈增生者。

1.2 主要试剂

TRPA1抗体(ab62053，1∶200)、TRPV4抗体(ab94868，1∶100)(Abcam公司，英国)；免疫组化试剂盒(封闭液、二抗、SAB复合物以及DAB显色试剂)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)法检测。步骤：将牙龈组织标本固定包埋后切片，脱蜡后EDTA修复抗原，3%H2O2孵育。BSA处理后分别加入一抗覆盖组织，以PBS为阴性对照4 ℃过夜后加入相应种属的二抗，孵育漂洗后加入新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察控制显色(阳性染色为棕黄色)。显色完全后冲洗切片，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水反蓝。将干燥透明后的切片封固待观察。

1.4 结果判定

由2 名病理科副主任医师分别单盲法阅片。采用判定标准[7]：对每张切片的阳性细胞数比例及着色深浅进行计分，以细胞质及细胞膜内出现棕黄色至深棕黄色为阳性，根据着色的强弱程度和阳性细胞所占百分比进行评定和分析。积分数=阳性染色细胞百分比评分×染色强度评分。阳性染色细胞百分比判定标准：每个标本都随机选择3个高倍视野(×200)，计数阳性细胞数占细胞总数的百分比(阳性细胞百分率):<5%为0 分；6%～25%为1 分；26%～50%为2 分；51%～75%为3 分；>75%为4 分。染色强度判定标准为：无着色为0 分；淡黄色为1 分；黄色为2 分；棕黄色为3 分；棕褐色为4 分。阳等级：1～4为阴性(-)；5～8 分为弱阳性(+)；9～12 分为阳性(++)。

1.5 统计学分析

采用IBM SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，相关性行Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TRPA1和TRPV4在牙龈瘤和正常组织的表达

正常牙龈组织中，TRPA1和TRPV4的表达多为弱阳性或阴性，主要表达于上皮基底层细胞、内皮细胞和成纤维细胞的细胞膜及细胞质(图 1)。在牙龈瘤中，TRPA1和TRPV4表达于表皮全层及间质的细胞质和细胞膜(图 2)。TRPA1和TRPV4阳性表达率分别为56.72%(114/201)和88.56%(178/201)，正常组阳性表达率分别为35.42%(17/48)和66.67%(32/48)，牙龈瘤组明显高于正常组(P<0.05)(表 1)。

图 1 TPRA1和TPRV4在正常组织中的表达(×200)

2.2 TRPA1和TRPV4表达与牙龈瘤患者临床参数之间关系

TRPA1和TRPV4表达与牙龈瘤患者临床参数之间关系见表 2。TRPA1和TRPV4表达与牙龈瘤患者年龄呈显著相关(P值分别为0.000、0.006)，且年龄越大，TRPA1和TRPV4表达越低。TRPA1和TRPV4表达与是否为药物性牙龈增生显著相关(P<0.001)，相比之下，二者均在非药物性牙龈增生中表达较高，在药物性牙龈增生中表达低。TRPA1和TRPV4表达与患者性别无关(P>0.05)；TRPA1表达与牙龈瘤患者病理分型无关(P>0.05)，而TRPV4表达与病理分型相关(P<0.05)，以血管性牙龈瘤阳性率最高95.35%(41/43)，其次是纤维性牙龈瘤92.59%(100/108)，肉芽肿性牙龈瘤阳性率较低74.00%(37/50)。

图 1 TRPA1和TRPV4在牙龈瘤组织中的表达×200)

表 1 TRPA1与TRPV4在牙龈瘤和正常组织中的表达

表 2 TRPA1与TRPV4在牙龈瘤中的表达与各临床参数之间的关系

2.3 牙龈瘤组织中TRPA1和TRPV4的相关性

牙龈瘤组织中TRPA1和TRPV4的相关性见表 3。牙龈瘤组织中TRPA1和TRPV4表达呈显著正相关(r=0.486，P<0.001)。

表 3 牙龈瘤组织中TRPA1和TRPV4的相关性

3 讨 论

TRP通道于1969 年首次在果蝇的视觉系统中被发现[8]，是非选择性阳离子通道，广泛分布于多种生物中。可被多种刺激激活，如机械牵张[9]、温度变化[10]、氧化应激[11]和炎性因子等，继而激活下游相关阳离子通路，参与细胞舒缩、增殖及分化等多种病理生理功能。不同的TRP通道对钙离子、镁离子、钠离子、氢离子等离子的通透选择性不一样。TRPA1激活后可以增加细胞外阳离子，如钠离子、氢离子，尤其是引起钙离子的内流，从而在氧化反应、炎症反应和血管扩张等过程中发挥重要作用。TRPA1主要在背根神经、三叉神经和迷走神经的初级感觉神经元中表达[12]。近年研究表明，大量非神经细胞也存在TRPA1的表达，如肺成纤维细胞、血管内皮细胞、牙髓成纤维细胞和牙本质细胞等[13-15]。López-González等[16]通过细胞实验研究发现TRPA1、TRPV1及TRPV1b在人牙龈成纤维细胞中表达。这与本实验中TRPA1在正常牙龈组织中表达结果一致。TRPV4广泛表达于感觉、消化、呼吸、心血管等系统，参与多种生理及病理过程。TRPV4可被温度、剪切力、渗透压等理化刺激激活，可引起钙离子、钠离子的流动，并主要通过对钙离子的调控及细胞内信号转导通路，产生异构体等不同连接方式，影响细胞增殖、分化、迁移和凋亡等，进而在肿瘤的发生发展中发挥作用[17]。与正常组织细胞比，TRPV4在多数肿瘤细胞中高表达，如肝癌、胃癌、肺鳞状细胞癌、结直肠癌等[17]；极少数情况下呈低表达，如前列腺癌和食管癌[18]。

目前，TRP通道在口腔疾病中的相关研究极少。EI等[19]发现人类龋齿大量表达成牙本质细胞。Kun等[20]研究发现小鼠结肠炎症反应中TRPA1 mRNA高表达。相反，Tazawa等[21]在新鲜分离的天然成牙本质细胞或牙髓组织中未发现TRPA1 mRNA，他们推测可能因为研究中所选牙齿均无炎症，以致TRPA1表达太低而无法检测到，而龋齿的成牙本质细胞感染和炎症改变了成牙本质细胞特性和TRPA1通道表达。本研究发现TRPA1在牙龈瘤中的表达显著高于正常组织，考虑牙龈瘤主要是炎症刺激等因素产生的，而正常组织中炎症因子极少，因而TRPA1表达较低，或者不表达。本研究发现，牙龈瘤中TRPV4的表达亦显著高于正常牙龈组织。李孝琼等[22]，通过阻滞TRPV4，能够抑制宫颈癌HeLa细胞(实验用增殖表皮癌细胞)增殖，并推测TRPV4在宫颈癌HeLa细胞异常增殖中可能具有负向调控作用。Yamada等[23]研究表明，TRPV4高表达后刺激肝星状细胞增殖，进而间接诱发肝癌。相较于TRPA1在口腔中的研究进展，TRPV4则鲜有报道。而TRPV4作为TRPVs家族中的一员，研究结果发现，TRPV4在牙龈瘤中高表达，在正常牙龈组织中也有表达，主要表达在上皮基底层细胞、内皮细胞和成纤维细胞的细胞膜及细胞质细胞中。

本研究发现TRPA1和TRPV4表达均与牙龈瘤患者性别无关，但二者均与年龄及是否为药物性牙龈增生显著相关。且本研究发现TRPA1和TRPV4在牙龈瘤中表达呈正相关。本研究入选的药物性牙龈增生患者以服用钙离子阻滞剂的高血压患者为主，国外资料显示钙通道阻滞剂引起药物性牙龈增生患病率为15%～85%，国内学者报道为20%[24]。钙通道阻滞剂的药理学机制是：作用于冠状血管和周围平滑肌细胞，且能够选择性阻滞细胞膜钙通道，阻止钙离子内流，减少细胞内可利用钙离子[25]。作为细胞内重要的第二信使，钙离子浓度变化引起细胞功能明显改变，而TRPA1和TRPV4均是以钙离子为主要透过性阳离子通道，推测钙离子阻滞剂类药物对两通道均有抑制作用，从而导致TRPA1和TRPV4在在非药物性牙龈增生中表达显著高于药物性牙龈增生，且差异有统计学意义，继而为探索药物性牙龈增生的机制提供新可能。而随着老龄化社会的进入，高血压患者逐渐增多，服用钙离子阻滞剂的患者也逐渐增加，因此，当年龄越大，药物性牙龈增生患者相对越多，则TRPA1和TRPV4表达就相对越低，恰与药物性牙龈增生表达较低结果一致。

本研究中，TRPA1表达与牙龈瘤患者病理分型无关，而TRPV4表达与之相关，且在血管性牙龈瘤中表达最高，肉芽肿性牙龈瘤中表达最低，推测可能与TRPV4在血管内皮细胞中大量表达有关。研究表明TRPA1基因最初是从人成纤维细胞中克隆的[26]然后在一部分神经纤维[27-28]中确定，而肺成纤维细胞中仅检测到TRPA1的表达[29]。研究表明TRPV4主要表达于血管内皮细胞和II型肺泡细胞中，少量表达于巨噬细胞、肥大细胞等炎细胞[30-31]。而肉芽肿性牙龈瘤中以大量炎细胞及部分新生血管为主，血管性牙龈瘤则以大量成熟血管为主，伴少量炎细胞。

本研究通过对TRPA1和TRPV4在牙龈瘤中的表达以及与牙龈瘤患者的临床病理参数之间的关系的研究，发现TRPA1和TRPV4均在牙龈瘤中高表达，提示二者可能与牙龈瘤发生相关，其具体机制有待研究。