正常幼儿及不同年龄段白内障患者晶状体中常见miRNA的表达

张 建，景瑞花，秦 莉，裴 澄，吴昌睿

0引言

白内障是世界首位致盲眼病，不同年龄段均可发病[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是包含21～25个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，能够在转录后水平对基因表达进行调控[2]。已有研究表明，miRNA在不同年龄段白内障的发生中发挥作用，但其具体机制尚不完全明确。既往研究证实，晶状体上皮细胞内miR-184，miR-204，miR-183，miR-181b，miR-182，miR-125b，miR-124，let-7a/b/d这10条miRNA显著高表达[3-7]，提示其可能在晶状体相关疾病中发挥重要作用。本研究通过检测晶状体中这10条常见miRNA的表达水平，比较其在正常幼儿及不同年龄段白内障患者晶状体中的表达差异，并进行靶基因预测、GO和 KEGG富集分析，为深入研究miRNA在不同年龄段白内障发生中的作用机制提供依据。

1对象和方法

1.1对象正常幼儿晶状体组织取自死亡8～24h的尸体眼，来源于西安交通大学医学院第一附属医院角膜移植供体患儿，透明晶状体6个，年龄1～4(平均2.2±0.6)岁；不同年龄段白内障晶状体组织来源于幼儿(先天性白内障)、中青年、老年(年龄相关性白内障)患者手术过程中撕除的前囊膜，其中幼儿白内障患者标本6例，年龄1～3(平均2.0±0.4)岁；中青年白内障患者标本6例，年龄29～45(平均38.7±4.5)岁；老年白内障患者标本6例，年龄62～68(平均65.3±6.8)岁。正常幼儿和白内障幼儿年龄差异无统计学意义(t=0.535，P=0.605)，幼儿、中青年和老年白内障患者各组间年龄差异有统计学意义(t=-16.892、-61.324、-21.432，均P<0.05)。所有病例均排除其他眼部病变，晶状体组织均取自晶状体前囊膜，每组标本随机平均分为3等份，用来进行重复试验。本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》，并征得患者及/或其监护人的知情同意，获得西安交通大学伦理委员会的批准。

1.2.1 stem-loop RT-PCR引物设计与合成miRNA检测需要三种引物，即stem-loop RT引物、miRNA特异性正向引物和一致的miRNA反向引物。stem-loop RT引物是一段含44个碱基的特定序列之后延续6个特异性碱基，这6个特异性碱基与miRNA 3’端的6个碱基反向互补。miRNA特异性正向引物是一段特定的富含GC的序列之后延续特异性碱基，该特异性碱基是由除外miRNA 3’端8个碱基后剩余碱基组成(表1)。一致的miRNA反向引物是一段特定的碱基序列(GTGCAGGGTCCGAGGT)。miRNA引物由西安壮志生物科技有限公司合成。

表1 miRNA序列及其stem-loop RT引物和特异性正向引物

1.2.2晶状体组织总RNA的提取(1)晶状体组织冰上匀浆后移入1.5mL EP管中，加Trizol试剂(美国Invitrogen公司)1mL，混匀，室温静置5min。(2)加氯仿0.2mL，震荡15s，室温静置3min，4℃、12 000g离心15min。(3)吸取上层水相0.4mL，移至另一EP管中，加0.4mL异丙醇，室温10min，4℃、12 000g离心10min。(4)倒掉上清液，加75%乙醇(无RNA酶水配置)1mL，震荡充分洗涤沉淀，4℃、7500g离心5min。(5)干燥后沉淀溶解于无RNA酶水中备用。

1.2.3 stem-loop RT-PCR法检测miRNA的表达每个样本取总RNA 1μL，2μmol/L stem-loop RT引物1μL，加入到RT体系中，震荡溶解后短暂离心，设置反应条件为42℃ cDNA合成60min，85℃反转录失活5s，-20℃保存备用。将RT反应后的cDNA溶液稀释为浓度0.5ng/μL，将miRNA正向引物和反向引物配制为浓度0.2μmol/L，取该两种溶液各5μL，并且与10μL SYBR green混合，反应体系为20μL，反应程序为：95℃ 3min 1个循环；95℃ 15s，60℃ 30s 40个循环，从65℃开始，每5s增加0.5℃到95℃，最后4℃结束。内参采用β-actin，引物序列：F：ACTACCTCATGAAGATCCTCA，R：CAGGAGGAGCAATGATCTTGA。逆转录PCR试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。PCR结果分析采用2-ΔΔCt方法进行计算，分析相对表达量。

1.2.4 miRNA靶基因预测及GO/KEGG富集分析本研究使用miRWalk2(http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)在线工具预测miRNA的靶基因，然后汇总并采用R语言clusterprofiler包(http：//www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html)对预测的靶基因进行GO和KEGG通路富集分析。

2结果

2.1常见的晶状体miRNA近年来不同研究者采用多种分子生物学技术(如Insituhybridization、Microarray等)检测逾50种miRNA在晶状体组织中的表达，不同方法检测晶状体组织中miRNA表达谱不尽相同，但部分miRNA表达丰度高且功能已经有了初步研究，文献中已有不同研究方法检测到了晶状体中miRNA的表达，见表2。

表2 不同方法检测晶状体中miRNA的表达

2.2正常幼儿晶状体中miRNA的表达使用stem-loop RT-PCR法检测上述10种miRNA在正常幼儿晶状体中的表达情况，发现所有的miRNA均可被检测，但是表达量各不相同(F=27，P=0.000068)，其中miR-184的Ct值(miRNA Ct值与其起始含量相关，起始含量越高，Ct值越小)明显低于其他miRNA，差异均有统计学意义(P=0.000092、0.000065、0.00043、0.00023、0.00012、0.00034、0.00056、0.00054、0.00012)，表明miR-184在正常幼儿晶状体中含量最高(图1)。

图1 正常幼儿晶状体组织中miRNA的表达 bP<0.01 vs miR-184。

2.3正常幼儿与先天性白内障幼儿晶状体中miRNA的表达使用stem-loop RT-PCR法检测正常幼儿与先天性白内障幼儿晶状体中miRNA的表达，结果发现，与正常幼儿相比，先天性白内障幼儿晶状体中6种miRNA表达升高(miR-184、miR-181b、miR-182、miR-183、miR-125b、let-7d)，其余均降低，其中miR-184、miR-182表达升高，差异具有统计学意义(t=12，P=0.0002；t=5.27，P=0.0061)，且miR-182表达升高最明显；miR-124、miR-204表达降低，差异具有统计学意义(t=8.6，P=0.0009；t=13，P=0.00015)，且miR-204降低最明显(图2)。

图2 正常幼儿与先天性白内障幼儿晶状体中miRNA的相对表达差异 bP<0.01 vs 正常幼儿。

2.4不同年龄段白内障患者晶状体中miRNA的表达使用stem-loop RT-PCR法检测不同年龄段白内障患者晶状体中miRNA的表达，结果发现，与幼儿患者相比，中青年和老年患者晶状体中miRNA表达均有变化(miR-184：F=91.3，P=0.00070；let-7a：F=82.19，P=0.00008；miR-204：F=32.09，P=0.00055；miR-181b：F=24.05，P=0.001；miR-182：F=31.99，P=0.0006；miR-183：F=120.9，P=0.0007；miR-125b：F=8.533，P=0.0176；miR-124：F=19.00，P=0.0025；let-7b：F=10.33，P=0.0114；let-7d：F=130.9，P=0.0001)，中青年患者晶状体中miR-204(P=0.034)、miR-124(P=0.033)、let-7d(P=0.00013)表达升高，miR-184(P=0.00009)、miR-183(P=0.0045)、let-7a(P=0.00005)表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；老年患者晶状体中miR-204(P=0.000085)、miR-182(P=0.0076)，miR-124(P=0.003)表达升高，miR-184(P=0.00006)、miR-181b(P=0.00096)、miR-183(P=0.00015)、miR-125b(P=0.003)、let-7a(P=0.00003)、let-7b(P=0.0176，P=0.005)、let-7d(P=0.023)表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 不同年龄段白内障患者晶状体中miRNA的相对表达差异 aP<0.05，bP<0.01 vs 幼儿。

2.5差异表达的miRNA靶基因通路富集分析由于年龄相关性白内障患者晶状体中10条miRNA均存在表达差异，为了探索其可能的功能机制，本研究使用miRWalk在线工具预测这10条miRNA的靶基因，共计2937个，并进行靶基因的GO和KEGG富集分析。靶基因的GO分析显示(图4A)，细胞与基质之间的连接富集最多，提示晶状体上皮细胞与囊袋及内层皮质之间的紧密连接在维持晶状体正常形态及透明性方面发挥重要作用。KEGG富集分析显示(图4B)，肿瘤相关通路富集最多，可能是由于肿瘤中miRNA研究最广泛所致，众所周知，晶状体无肿瘤性疾病。其次细胞周期排名靠前，而晶状体上皮细胞的过度凋亡是白内障的细胞学基础[8]，细胞周期与细胞凋亡紧密相关，进一步说明miRNA在调控白内障中发挥着重要作用。

图4 miRNA靶基因GO和KEGG富集分析 A：10条miRNA靶基因GO富集分析；B：10条miRNA靶基因KEGG富集分析。

3讨论

miRNA可调节人类基因组中约1/3基因的表达，功能涉及生物体多种生理和病理过程[9]。近年研究发现，部分miRNA在晶状体中稳定表达，它们的功能与白内障的发生相关。本课题组之前的研究使用Microarry技术在成人正常晶状体中检测发现206种miRNA表达，其中miR-184表达最丰富，其后依次为let-7b、miR-923、miR-1826、miR-125b、miR-1308、miR-26a和miR-638，而在不同年龄段的白内障患者晶状体中miRNA表达谱差异明显[10]。不同研究报道晶状体中miRNA表达谱不尽相同，但部分晶状体相关的miRNA(表2)始终稳定表达。目前常见晶状体相关miRNA的研究多集中在老年人(正常或白内障)晶状体组织中，对其在幼儿及中青年晶状体组织中表达的研究较少。本研究提取正常幼儿晶状体组织总RNA，检测其中常见晶状体相关miRNA的表达，结果发现该类miRNA在正常幼儿晶状体组织中均有表达，表达量各不相同，其中miR-184的Ct值明显低于其他miRNA，表明miR-184在正常幼儿晶状体组织中表达量最高，这与本课题组之前在成人透明晶状体中的研究结果一致。miR-184在角膜上皮细胞中被首次报道，是角膜和晶状体组织中显著表达的一种miRNA，研究发现，miR-184可以抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达，通过维持SHIP2(SH2结构域的Ⅱ型肌醇5’磷酸酶)的水平抑制血管生长，在维持正常角膜无血管状态中发挥重要作用。晶状体也是眼部重要的屈光介质之一，无血管状态保证了其基本的屈光功能，miR-184在晶状体中的高表达可能与其能够维持无血管状态相关[11-12]。

此外，有研究报道多种miRNA表达与白内障的发生相关。Yao等[13]在不同生长阶段鼠的晶状体中检测miRNA的表达，发现miR-29c可通过调节FOS影响白内障的发生；在研究晶状体生长、衰老过程中，Chien等研究发现与组织衰老相关的miR-34a表达量与晶状体混浊程度呈正相关，严重混浊的晶状体中其表达水平较高，甚至有学者认为miR-34a可以作为白内障的一种标记物[14-15]。虽然有关miRNA调节白内障发生的研究越来越多，但在先天性白内障幼儿晶状体中是否有miRNA表达的改变仍罕有报道。因此，本研究检测先天性白内障幼儿晶状体中miRNA的表达并与正常幼儿进行比较，发现在先天性白内障幼儿晶状体中多种miRNA表达发生变化，其中miR-184、miR-182表达升高，miR-124、miR-204表达降低。既往研究报道，在晶状体中miR-124与HuB/C/D、nPTB、REST4相互作用，能够维持晶状体细胞的正常特性，保持晶状体透明[16]，同时Conte等[17]研究表明在胚胎发育早期敲除miR-204基因的动物模型会出现晶状体异常、小眼球等体征。本研究中，先天性白内障幼儿晶状体miR-124和miR-204表达明显降低，这与之前的研究结果相似，进一步证实了miR-124和miR-204对维持晶状体正常功能及特性的重要性。

为了进一步揭示miRNA在不同年龄段白内障患者晶状体中的表达情况，我们分别对幼儿(先天性白内障)、中青年、老年(年龄相关性白内障)患者晶状体中miRNA的表达进行了检测，结果发现，与先天性白内障幼儿相比，中青年白内障患者晶状体miR-204、miR-124和let-7d表达升高，miR-184、miR-183和let-7a表达降低；年龄相关性白内障患者晶状体所有被检测miRNA表达均有变化，其中miR-182、miR-204、miR-124表达升高，miR-184、miR-181b、miR-183、miR-125b、let-7a/b/d表达均降低。在表达差异miRNA中，已经发现miR-182在感觉器官中特异性表达，大鼠眼部组织中检测其表达丰富，且具有重要作用[18-19]，Li等[20]发现miR-182与衰老相关，其可能通过调节RARG的表达引起细胞过早发生衰竭和死亡。衰老是年龄相关性白内障发生的根本原因，本研究发现年龄相关性白内障患者晶状体中miR-182表达明显高于先天性和中青年白内障患者，这进一步说明了miR-182与衰老相关，并可能在年龄相关性白内障的发生中发挥重要作用。

综上所述，目前关于miRNA在晶状体中表达的研究逐年增加，但尚未见正常幼儿和不同年龄段白内障患者晶状体中miRNA表达比较的报道。本研究在正常幼儿和不同年龄段白内障患者晶状体中检测发现多种miRNA表达，其中miR-184在正常幼儿晶状体中表达量最高；miR-124和miR-204在先天性白内障幼儿晶状体中的表达明显低于正常幼儿，分析可能与它们维持晶状体正常功能和特性相关；年龄相关性白内障患者晶状体中miR-182表达量明显增加，分析可能与miR-182调节衰老相关。上述结果表明，miRNA在不同年龄段白内障发生过程中发挥不同作用，但其具体的作用机制尚待深入的研究。

1李宇博, 王峰, 苏颖. miR-15a在眼科疾病中的研究现状及进展. 国际眼科杂志 2020; 20(6): 999-1002