干式时间分辨荧光免疫层析法检测血清抗链球菌溶血素“O”的方法学性能验证

王玲萍,许 中,陆茜莹，陆仁伟,周 伟，刘 琴

(1.苏州市相城区漕湖人民医院检验科，江苏苏州215144；2.苏州市立医院东区检验科,江苏苏州 215001； 3.上海捷门生物技术有限公司，上海 201806）

抗链球菌溶血素O（antistreptolysin O，ASO）的定量检测可作为临床链球菌感染后引发变态反应性疾病（风湿热、肾小球肾炎等）的辅助诊断指标[1]。传统的ELISA法操作复杂且特异度和重复性不理想而应用甚少。免疫透射比浊法虽常用，但有灵敏度低，检测范围较窄。免疫散射速率法结果准确，但仪器试剂进口价格昂贵，基层单位尚难普及。国内近年推出的时间分辨荧光免疫层析法（time-resolved fluorescence immuno chromatography，TRFIC）相对而言其设备简单，操作便利，同时又兼具较好的灵敏度和准确度，是一种较易推广使用的方法学平台。为评价其在临床应用可行性，我们对荧光免疫层析法血清抗链球菌溶血素“O”检测试剂盒进行了临床实验室方法学性能验证，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2019年5月份门诊及住院患者检测ASO的血清样本共61例，其中阳性标本33例，均由苏州市立医院东区提供。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 试剂：实验所用ASO时间分辨荧光免疫层析法检测试剂及相应的校准品和质控品均由上海捷门生物技术有限公司提供。对比试验所用散射速率法试剂由美国贝克曼公司提供。

1.2.2 主要仪器：干式时间分辨荧光分析仪（FIT-1000）及配套ASO检测试剂由上海捷门生物技术有限公司提供。美国贝克曼公司IMMAGE800特定蛋白测定仪。

1.3 方法

1.3.1 方法学原理：固相双抗原夹心法免疫试验，待测样本中所含的ASO，首先与链球菌溶血素O(streptolysin O，SLO)-稀土离子螯合物荧光乳胶微球结合，通过层析分离作用被固定在硝酸纤维素膜上的SLO（T线）捕获，T线荧光信号被配套仪器定量测定，荧光强度与样本中ASO浓度呈正相关。

1.3.2 正确度评估试验：选用生产厂商提供的低 (83.2IU/ml) 、中(136.0IU/ml)和高(269.0IU/ml)浓度ASO校准品。校准品复溶后连续测试3次。

1.3.3 精密度评估试验：采用简易精密度评估实验。随机测试ASO低、高两个浓度的临床血清样品，每个浓度标本连续测定4天，每天重复3次，共测试l2次。

1.3.4 线性评估试验：参考CLSI EP6-A[2]文件方案，将低浓度水平混合血清、高浓度水平混合血清，按照体积比制备成浓度分别为50，180，360，540，720和900IU/ml。每个样本平行测试3次。

1.3.5 临床样本比对试验：收集临床样本61例，分别使用贝克曼IMMAGE800散射速率法[参考方法 (X)]和荧光免疫层析法[实验方法(Y)]进行检测。

1.3.6 受试者工作曲线（ROC）测试评价：以临床推荐使用的美国贝克曼公司IMMAGE800散射速率法检测ASO作为参考标准，以该仪器检测ASO≥116IU/ml为诊断阳性（Pos.），＜116IU/ml为阴性（Neg.），进行受试者工作曲线（ROC）测试评价。

1.4 统计学分析 使用EP Evaluator分析软件进行统计学分析。采用Pearson相关系数 (r)和配对t检验分析两种方法之间的差异，当r＞0.95时认为相关性好。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正确度评估结果 见表1。低、中、高3个浓度的ASO校准品相对偏倚分别为-1.24%，-0.99%及2.70%，均在行业标准所列相对偏倚范围内。

表1 正确度评估试验结果

2.2 精密度评估试验结果 低(18.6IU/ml) 、高(226.0IU/ml)两个浓度样本的CV分别为8.32%和6.39%，均在厂商声明范围（≤10%）内。

2.3 线性评估试验结果 见图1。ASO浓度在46.37～868.13IU/ml时检测呈线性，直线回归方程为Y=0.958 8X-3.889，r2=0.998 5。线性范围符合厂商声明区间(50～800IU/ml)。

图1 ASO线性试验结果

2.4 临床样品比对试验结果 见图2。比对试验按照EP Evaluator软件中的两种仪器 (方法) 比对模式进行。Deming回归方程截距(intercept)和斜率(slope)分别为-6.51 (95%CI:-28.28～15.25)和1.256 (95%CI:1.154～1.359)，r为0.950 6，相关性良好。

2.5 受试者工作曲线（ROC）评价结果 FIA-1000荧光免疫层析法检测ASO的ROC曲线见图3。曲线下面积（AUC）为0.942，标准误为0.03，最靠左上角的截割点即最佳临床诊断Cutoff值为150.8IU/ml。以ASO≥150.8IU/ml为诊断Cutoff值，其灵敏度为90.9% （95% CI 76.4%～96.9%），特异度为89.3% （95% CI 72.8% ～96.3% ），阳性及阴性似然比分别为8.48和0.10，阳性及阴性预测值分别为90.9% 和89.3% ，有效性为90.2% 。

图2 两种ASO检测方法临床样品比对结果

图3 荧光免疫层析法检测ASO的ROC曲线图

3 讨论

本研究结果显示，时间分辨荧光免疫层析法测定ASO具有良好的正确度和精密度，在845IU/ml浓度范围内线性良好，与免疫比浊法的线性范围接近[3]。和参考方法相比也有较好的相关性。同时，本研究亦对确定该荧光免疫层析法的参考值范围进行了初步尝试，以ASO≥150.8IU/ml作为诊断的Cutoff值。但因观察例数尚少，故在开展ASO荧光免疫层析法定量的临床检测时，还需进行实验室的参考值调查。

方法学性能验证数据表明，FIA-1000时间分辨荧光免疫层析法检测ASO能满足临床常规检测应用，但也应看到该荧光免疫法既要注意时间、温度等影响因素，同时也需对溶血、黄疸、脂血进行干扰试验。有文献报道，在类风湿关节炎伴随有链球菌感染时，ASO亦有轻度升高，有较好的诊断价值[4]。这些有待进一步的病例试验和研究。

在临床特种蛋白的检测实践中，ASO是一项不可或缺的常用指标，其检测方法学近20多年的发展演变，经过了从定性乳胶凝集到定量的免疫比浊法的进展[5-6]，产生了为数不少的介绍和评价二者各自特点的文献[7-10]。这些都是基于对经典的免疫复合物微粒的浓度检测。目前，国内规模医院均已使用进口免疫散射速率法来定量检测ASO[11-12]。尽管临床符合性较好，但因此类仪器设备昂贵，不少基层医院仍在使用传统的乳胶凝集法定性检测ASO，影响了临床诊断的准确性、及时性。FIA-1000时间分辨荧光免疫分析仪及配套试剂，使用一次性测试卡，采用了目前已广泛应用的现代免疫荧光标记技术[13-14]，利用稀土元素铕的荧光效应，在机体本底荧光消退后实现免疫复合物荧光测定。在样本处理和测试操作上实现了随到随做，操作简单。报告结果时间耗时不超过30min，大大方便了病人，适于在各临床医疗机构尤其是中小医院开展。