新型冠状病毒核酸、抗原和抗体联合检测的临床价值讨论

张 园，周泽奇，王志贤，粟 艳，肖 盟，徐英春，王 贺

（1.“侵袭性真菌病机制研究与精准诊断”北京市重点实验室丹娜生物分中心，天津 300467；2.中国医学科学院北京协和医院检验科，北京100730；3.“侵袭性真菌病机制研究与精准诊断”北京市 重点实验室（BZ0447），北京100730）

自2020年1月报道新型冠状病毒（SARS-CoV-2）在人与人之间传播以来，早期识别新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者是所有疫情区的防控重点。截止5月底，全球200多个国家和地区累计确诊500多万人，近33万人丧生。研究观察SARSCoV-2无症状患者的比例约占40%[1-2]，加速了SARS-CoV-2在全球的迅速传播，因此遏制该病毒面临严峻挑战。核酸和免疫学检测在诊断中发挥重要作用，核酸、抗原和抗体联合检测可以显著提高检出率，在治疗监测、病程转归和预后等方面发挥重要作用，本文将最新的研究进行总结，具体如下。

1 核酸检测研究现状

1.1 核酸检测原理及机制 SARS-CoV-2的核酸检测包括测序和靶标序列识别，靶标序列一般是指高度保守的ORF1ab基因、核衣壳蛋白N基因、包膜蛋白E基因和刺突糖蛋白S基因。S蛋白与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme2,ACE2）受体结合致病[3]。依据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》SARS-CoV-2扩增位置常见于ORF1ab和N基因两个靶标[4]。目前，同一份标本需满足核酸检测双靶标阳性或重复检测单靶标阳性，判定为阳性。核酸检测阴性不能完全排除SARS-CoV-2感染，需结合临床症状综合判断[5]。中国药品监督管理局批准上市的核酸检测方法有实时荧光PCR法、恒温扩增芯片法、恒温扩增实时荧光法等。

1.2 核酸检测的临床价值 新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第二版至第七版）核酸检测是疑似病例确诊依据之一，是出院标准的重要参考，也是早期病原学诊断方法，为疫情防控提供了有力保障。河南省疾病预防控制中心共纳入6 714份病人样本，确诊病例1 200例，疑似病例2 178例，无症状感染者77例。确诊病例呼吸道标本核酸阳性率63.10%，鼻拭子、痰液和咽拭子的核酸阳性率分别为50.80%，58.71%，65.21%。发病后1周、2周、3周、4周、5周及5周以上呼吸道样本确诊病例阳性率依次为89.03%，86.57%，52.30%，17.53%，17.69%和24.14%，发病后1周内核酸检出率最高，表明核酸检测是最有效的早期病原学检测方法[6]。国家传染病临床研究中心的研究结论相似，在病程的1～7天敏感度为66.7%，在病程的8～14天敏感度为54.0%，在病程的15～39天敏感度为45.5%，提示在病程的中后期核酸检出率降低[2]。还有研究在738例COVID-19家庭成员无症状医学观察中核酸阳性率高达9.49%。70例核酸检测阳性无症状患者45.71%在30天内转为确诊，证明核酸检测时病毒已侵入体内，未引起全身免疫性反应，已具有一定的传染性[7]。核酸检测有利于尽早发现无症状感染者，提前干预治疗，避免或缩短病程，减轻患者症状，有助于疫情早期防控[8]。

1.3 核酸检测的局限性 核酸检测敏感度受病毒本身及采样、处理、运输、保存、受试者和试剂质量等影响，未完全满足临床需求[9]。①病毒感染时间的延长，机体进入免疫应答，抗体可中和病毒，病毒复制被抑制，产生假阴性。②核酸检测样本包括鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等[10-11]。下呼吸道标本如痰液、气道抽取物或肺泡灌洗液更加准确。③核酸检测操作复杂、耗时长、技术人员要求高、传染风险大，不适宜用于疑似患者和密切接触人群的快速筛查。迫切需要多元化的检测方法，其中抗体检测是首选。

2 抗体检测的研究现状

2.1 抗体检测原理及机制 病毒入侵机体后作为免疫原被吞噬细胞吞噬，吞噬细胞呈递抗原给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞产生特异性抗体。IgM是初次免疫应答最早出现的抗体，提示急性感染，亲和力较低，持续时间短。IgG发挥保护作用是再次免疫应答的主要抗体，提示病情进入中后期或既往感染；持续时间长并且抗体滴度较高。抗体检测可作为判断病毒在不同时间窗的间接证据[12-13]，图1为核酸、抗原和抗体检测的时间窗。

图1 核酸、抗原、抗体检测的时间窗

理论上，特异性抗体通过免疫复合物的形式中和病毒，使病毒失活并清除，抗体浓度越高越好，但研究证实恰恰相反。复旦大学针对175例患者的血浆样本研究发现总抗体滴度越高，患者病情越重[12]。武汉大学人民医院研究证实IgG抗体和中性粒细胞与淋巴细胞的比值（NLR）对患者病情严重程度的预测及预后有关。NLR代表先天性免疫，而IgG代表后天获得性免疫。研究发现IgG水平越高，NLR比值越高，患者病情越危重[14]。以上研究揭示特异性抗体的产生是把双刃剑，既可以清除病毒，也可能促进病毒的复制，加重对机体的损害，可能是IgG抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement,ADE）起作用。通常，人体感染病毒，会产生中和抗体和非中和抗体。当体内中和抗体水平非常高，足以与病毒的关键蛋白结合阻断病毒感染，则不产生ADE效应。当中和抗体的浓度不够高，不能与病毒表面蛋白充分结合，可促进病毒与细胞的结合，有可能引发ADE效应[15-16]。

山东大学研究表明SARS-CoV-2可以在已产生特异性抗体的患者体内长期存在，1例患者病毒和抗体共存长达50天，另1例在观察的66天内，一直没有产生抗体，最终核酸检测转阴，这表明抗体并不是清除病毒的必要条件，有些患者在感染后可能并不产生抗体[17]。复旦大学研究对175例轻度症状康复者的血浆进行了筛选，发现这些患者中尽管病毒核酸检测阳性，但30%的患者抗体滴度很低，有10例患者未能检出抗体，即使出院后复查，也没有检测到，这些患者的康复更多是依靠T细胞免疫作用[18]。

2.2 抗体检测的临床价值 广州呼吸健康研究院证实IgM和IgG抗体联合检测的敏感度高于单独的IgM或IgG抗体检测[13]。武汉大学人民医院检验科对205例COVID-19患者进行抗体检测，IgM和IgG敏感度分别为70.24%和96.10%，抗体联合检测敏感度提高[19]。

天津市疾病预防控制中心研究不同病程患者IgM和IgG的抗体水平，IgM抗体水平在病程早期和中期呈上升趋势，在中期最高，后期IgM抗体水平呈下降趋势。IgG抗体水平在病程早期、中期及后期呈逐渐升高的趋势，尤其在病程的后期抗体水平最高，与早期相比呈4倍升高，这与机体免疫应答规律一致，IgM抗体先升高后降低，IgG抗体产生晚于IgM抗体，可较长时间高浓度存在。因此，如果要筛查出急性感染和复发感染患者，则需要核酸配合抗体检测，这对疫情防控有十分重要的价值[20]。

2.3 抗体检测的局限性 ①抗原选择是否与SARSCoV或其亚属冠状病毒有交叉反应；②抗体检测方法学所涉及的试剂盒阳性判断值的设定要合理，一些处于阳性判断值附近的弱阳性很可能是假阳性；③患者标本中存在导致免疫测定假阳性的内源性或外源性干扰物质的存在，内源性干扰物质一般包括类风湿因子（RF）、嗜异性抗体、补体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体等。

3 抗原检测的研究现状

3.1 抗原检测的原理及机制 抗原是指SARS-CoV-2病原体引发免疫反应的部分。SARS-CoV-2的N蛋白和S蛋白具有很强的抗原性，在诱导宿主免疫应答与发病机制中发挥重要作用。抗原可用作SARS-CoV-2检测的抗原位点，类似于PCR检测，抗原检测可用于COVID-19早期病原体感染的直接证据。

3.2 抗原检测局限性 ①抗原制备时间长。获得特异度高、纯度高、活性高的抗原需要数月时间，包括完成抗原重组表达、筛选、分离、纯化、鉴定与制备等工艺流程。②抗原检测试剂盒的开发需要获得敏感度高、特异度高的抗体，该类抗体的选择与制备有很多困难，需要数月乃至更长时间。③抗原检测不像核酸检测获得较高的检测灵敏度。④SARS-CoV-2 N蛋白与其它SARS-CoV N蛋白存在交叉反应的干忧。虽然有一些研发团队在开发此类产品，因制备难度大、技术不够成熟，尚未获得临床认可。抗原检测方法有待进一步开发与优化，早日获准上市。

4 联合检测优势和结果判读

WHO发布COVID-19疑似病例实验室检测指南中核酸检测仍是金标准，血清学检测可以辅助调查现有疫情暴发情况以及回顾性评价发病率或者疫情蔓延趋势。当患者核酸检测呈阴性，但有COVID-19流行病学史，血清学检测可作为辅助诊断[21]。

深圳市疾病预防控制中心的研究结果证实第2周核酸已转阴患者的抗体水平显著高于核酸阳性患者的抗体水平，证明在病程早期高水平IgG抗体对病毒清除具有一定作用[22]。华中科技大学附属同济医院的研究结果显示COVID-19患者的IgM高峰时间为核酸检测转阴后第4天，随后IgM水平下降；IgG水平在核酸阴性前4天就已升高至正常值约20倍，在核酸检测转阴后4天已达到高峰，随后稳定在峰值。IgM和IgG抗体检测可减少核酸检测假阴性。湖南中医药大学研究结果核酸检测转阴后血清IgM抗体阳性率为52.9%，低于核酸检测转阴前IgM抗体阳性率88.2%[23]。

武汉大学人民医院检验科研究证实抗体检测可以弥补核酸检测不足，19例具有临床症状及CT影像学特征但核酸检测阴性的临床诊断COVID-19患者，16例IgM抗体检测呈阳性，占84.21%；18例IgG抗体检测呈阳性，占94.74%[19]。国家传染病临床研究中心的研究结果证实抗体联合核酸检测敏感性高，在病程的1～7天共94例，核酸检测敏感性为66.7%，联合检测的敏感性为78.7%；在病程的8-14天共135例，核酸检测敏感度为54.0%，联合检测的敏感度为97%；在病程的15～39天共90例，核酸检测敏感度为45.5%，联合检测的敏感度为100%[2]。由此可见，在COVID-19患者病程的中后期，联合检测可显著提高检出率。

IgM和IgG抗体联合检测优劣势在于：①可以弥补核酸检测不足而显著提高敏感度，尤其在临床上有症状的患者或高风险人群，使用抗体检测是非常有效的手段。②较核酸检测更准确地判断疾病的进程，抗体检测是SARS-Cov2感染的间接证据，其中IgM呈阳性指示患者为急性感染；而IgG呈阳性指示患者为既往感染。③通过核酸及抗体联合检测可进行健康人群的流行病学调查，抗体检测更适合在流行率高的人群进行，当人群流行率低，特别是显著低于试剂的假阳性率，适用性显著降低。

综上所述，SARS-CoV-2核酸检测是金标准,为早期检测病原体的直接证据，抗体检测是有效的辅助诊断，是核酸检测的重要补充，为检测病原体的间接证据，也是未来疫苗研发和应用判断的重要指标。核酸、抗原和抗体检测与临床症状和CT影像学特征有机结合，在精准诊疗有十分重要的临床价值。