尿干化学法和离心沉渣镜检法检测穿刺羊水母体细胞污染的应用

林俊伟，章 钧，侯红瑛，叶燕绸，詹龙生，刘 城

（中山大学附属第三医院妇产科，广州 510630）

产前诊断不断发展在提高人口素质，减少出生缺陷方面意义重大，但现有研究发现羊水母体细胞污染（materall cell contamination，MCC）是影响产前诊断结果准确性的主要因素之一[1]。产前诊断羊膜腔穿刺有创性是导致羊水MCC主要原因，不同单位羊水穿刺MCC发生率差异较大，据相关报道羊水MCC发生可高达68%[2]，发生差异性跟穿刺者的经验、手法以及孕妇个体情况等有一定相关。大部分母血污染羊水血性程度不明显，即使是离心后的非血性污染的羊水样本仍有存在MCC可能，需要进一步鉴别。目前鉴别MCC分子技术主要为荧光定量PCR（QF-PCR），基因芯片（CMA，SNP Array)等，现有技术对实验室条件要求高，操作繁琐，设备昂贵，报告周期长，本研究通过联合使用尿干化学法和离心沉渣镜检法鉴定羊水MCC，寻找一种在报告周期、检测成本、操作过程等方面都优于分子检测技术的鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年6～10月孕16～24周在我院产检孕妇30例，具备产前诊断指征，遵照知情同意原则，采集羊水与全血样本。

1.2 仪器和试剂 仪器：移液器、1.5ml无菌离心管及无菌吸头，15ml无菌尖底离心管，台式高速离心机，旋涡振荡器，干燥仪或金属浴，尿干化学分析仪（罗氏u411），PCR扩增仪(9600美国ABI公司)。试剂：基因组DNA快速提取试剂盒，蛋白酶K，0.25g/dl胰酶，Buffer AL(德国Qiagen公司)，尿干化学试纸条（罗氏公司）。

1.3 方法

1.3.1 羊水与全血DNA提取：采集10 ml羊水标本2 500r/min离心10 min，收集沉淀，留取200 μl的细胞沉淀液,每份样品中加入20μl的蛋白酶K,200μl的buffer AL震荡混匀，金属浴56℃孵育10min，DNA进行浓度纯度检测。取200μl全血同上操作提取DNA进行浓度检测。

1.3.2 收集30例全血（200μl/份）与羊水（10ml/管）样本提取DNA：结果按照10%母体DNA污染率换算出对应全血体积及与10ml羊水体积比，换算方式：A=B*10%/C，其中A为10ml羊水中10% 母体DNA污染的全血体积，B为10ml羊水DNA总量，C为每微升体积全血DNA浓度。根据10% MCC母血与羊水体积比建立分别为5%，10%，20%，30% MCC污染梯度模型。

1.3.3 通过尿干化学法及沉渣镜检法对模型白细胞进行检测：尿干化学法严格按照相关操作规范及说明书进行操作，结果判读：结果≥1+为阳性，“neg”为阴性；离心沉渣镜检:标本离心2 500/5min，分离去上清液，取沉渣0.2ml置于玻璃片上，显微镜下计数白细胞数（WBC），结果判读：WBC≥1/HP为阳性，WBC=0/HP为阴性。

1.4 统计学分析 计数资料采用率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

羊水MCC模型通过尿干化学法与离心沉渣镜检法联合检测，污染率为30%，20%时两种方法检出率均为100%，检出率一致；污染率为10%和5%时尿干化学法检出率分别为60%，16.67%；离心沉渣镜检法检出率分别为100%，60%，两种方法在污染率为10%与5%的检出率差异均有统计学意义（χ2=11.915～15.000，均P＜0.01）。尿干化学法对20%以上母体DNA污染检出率为100%，离心沉渣镜检法对10%以上母体DNA污染检出率为100%，两种方法检出率与污染率呈正比关系，见表1。

表1 尿干化学法与沉渣镜检法检测30例不同比例羊水MCC结果分析

3 讨论

美国医学遗传学和基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定产前诊断样本MCC的检测规范，规范要求所有进行分子诊断和分子遗传学检测的产前标本都要常规进行MCC检测，排除MCC的潜在影响，来确保检测结果的准确性[3]。QF-PCR(荧光定量PCR)是目前鉴定MCC常用技术，但技术要求高，周期长且无法检测低于10%母体DNA污染[4]。

羊水MCC是母体血细胞污染，主要是由于羊膜腔穿刺出血导致，通过快速检测全血中白细胞可以判断MCC存在。全血中性粒细胞占白细胞总数55%～70%[5]，尿干化学酯酶法是通过中性粒细胞破裂释放特异性中性粒酯酶水解吲哚酚酯生成吲哚酚和有机酸引起试纸条颜色发生变化来反映样本中中性粒细胞存在[6]，由于羊水沉淀胎儿成分无白细胞，当穿刺发生MCC时，羊水沉淀中存在母体白细胞污染，检测羊水白细胞成分可提示MCC。本研究发现对于MCC大于20%时，尿干化学法与沉渣镜检法均做出阳性判断，MCC低于20%时中性粒酯酶浓度降低，尿干化学法检出率降低，MCC污染比例为10%时，尿干化学法在30例样本中12例检测结果为阴性，检出率为60%，原因为随着污染比例降低，中性粒酯酶浓度降低，当中性粒酯酶浓度低于检测下限时检测结果为阴性。离心沉渣镜检法对MCC大于10%羊水样本检出率为100%，但随着污染比例降低每高倍镜视野下白细胞数量减少，本研究在MCC比例为5%时发现有12例样本镜下尽管能看到红细胞存在但视野下白细胞数为0/HP,结果划分为阴性，增加计数在不同视野可发现个别白细胞，但由于检出率低，因此对低于10%母体DNA污染的羊水该方法检出率低。MCC浓度影响两种方法的检出率，两者呈正相关，但对于MCC检出率影响还有一些羊水本身因素干扰。

羊水中糖及蛋白可导致尿干化学法检测结果偏低[7]，而中性粒细胞酯酶释放需要中性粒细胞破裂为前提，新鲜羊水样本中性粒酯酶浓度偏低影响尿干化学法检出率，而沉渣镜检法在显微镜下观察白细胞数量可更直观地反映MCC情况；羊水pH一般在8.0～9.0，中性粒细胞在碱性环境中容易破裂[6]，当羊水样本存放时间过长时白细胞数破裂增多，沉渣镜检法结果可偏低或出现假阴性，而中性粒细胞破裂会释放出更多中性粒酯酶有助于提高尿干化学法检测率。因此尿干化学法与沉渣镜检法联合检测可以提高羊水MCC检出率。

一般情况下羊水MCC都会出现不同程度血性，高比例MCC根据血性外观可以判断存在污染，但并非所有高比例MCC羊水样本都呈血性外观。隐匿性绒毛膜羊膜炎一般无明显临床表现及监测手段，绒毛膜中性粒细胞增加形成一定梯度向羊膜腔移动[8]，羊膜腔穿刺时中性粒细胞或中性粒细胞酯酶混入羊水导致MCC比例增加，由于没有红细胞混入，羊水外观无明显血性。尿干化学法可以直接检测中性粒细胞酯酶存在，因此当发生隐匿性绒毛膜羊膜炎导致羊水MCC时，尿干化学法能更好地做出阳性判断。

综上所述，尿干化学法与沉渣镜检法联合检测可以作为羊水MCC鉴定手段，相对分子技术可节约成本，提高产前诊断效率，缩短报告等待周期，缓解患者焦虑心情，减轻患者经济负担同时对隐匿性绒毛膜羊膜炎有提示作用。