肺癌患者血浆miR-3151表达水平与临床病理特征的相关性研究

赵 格，高 琼，余宗涛，彭春艳，张吉才

（1.锦州医科大学十堰市太和医院研究生培养基地 湖北医药学院附属医院，湖北十堰 442000； 2.十堰市太和医院a.检验部；b.呼吸内科,湖北十堰 442000）

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，死亡率高[1]。及时准确的诊断是提高治疗效果和患者生存率的关键。微小RNA（miRNA）是一类长约19～25个核苷酸的非编码RNA，主要在转录后水平调控基因表达[2]。miRNA广泛参与人类生理病理过程，其表达失调与肿瘤的发生和进展相关[3-4]。目前关于miR-3151的研究多集中在血液系统肿瘤上，而对于其在肺癌中的表达情况知之甚少。本研究旨在探讨血浆miRNA-3151的表达水平与肺癌患者临床病理特征的关系，并评估其应用于肺癌诊断的可行性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集十堰市太和医院于2018年10月～2019年10月期间确诊的120例肺癌患者的血浆样本，其中男性82例，女性38例，平均年龄61.21±7.59岁。病理类型：腺癌65例，鳞癌37例，小细胞肺癌18例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期55例，Ⅲ～Ⅳ期47例。纳入标准：①经病理检查确诊；②未接受任何抗肿瘤治疗；③无并发其他类型肿瘤；④临床资料完整。收集同期120例体检健康者的血浆样本，其中男性75例，女性45例，平均年龄59.94±7.04岁。肺癌组和对照组间性别、年龄差异无统计学意义（均P＞0.05）。所有受试者均征得书面知情同意，研究方案经十堰市太和医院临床研究伦理委员会批准。

1.2 仪器及试剂 游离miRNA提取试剂盒（磁珠法）及miRNA反转录试剂盒（RG104-100）购于上海汇真生物科技有限公司，TransStart@Probe qPCR SuperMix (AQ401)试剂盒购于北京全式金生物公司。引物、探针及标准品均由上海生工生物工程有限公司合成。ABI ViiA7实时荧光定量PCR仪购于美国Life公司。细胞角蛋白19片段测定试剂盒（化学发光免疫分析法）、癌胚抗原测定试剂盒、神经元特异性烯醇化酶测定试剂盒及迈瑞CL-900i全自动化学发光免疫分析仪均购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集与处理：所有受试者均采集外周静脉血2ml，进行第一次离心（4℃，1 600g，10min），吸取所得血浆进行第二次离心（4℃，16 000g，10min），吸取第二次离心所得血浆置于-80°C贮存备用，以上操作均在样本离体后1h内完成。

1.3.2 血浆miRNA的提取及逆转录：使用miRNA提取试剂盒按照说明书要求提取血浆miRNA，提取所得miRNA置于-80℃储存备用。逆转录采用20μl体系，包含miRNA 10μl，反应缓冲液4μl，核酸混合液4μl，酶Ⅰ0.5μl，酶Ⅱ0.2μl以及无酶水1.3μl。反应程序为42℃ 60min,85℃ 30s，反应结束后进行下一步操作或置于-20℃保存备用。

1.3.3 RT-PCR反应：RT-PCR采用20μl反应体系：cDNA 2μl，miRNA正、反向引物各0.4μl，探 针0.4μl，2×TransStart@Probe qPCR SuperMix 10μl，Passive Reference Dye(50×)（optional）0.4μl，无酶水6.4μl。每个标本设置3复孔，反应程序为94℃ 30s；94℃ 5s，60℃ 30s，45个循环。使用绝对定量的方法检测样本中miR-3151的表达量，以miR-126作为标准品做标准曲线，通过以下公式计算样本中miR-3151的浓度，其中C为浓度，单位是nmol/L，Ct是经RT-PCR得到的Ct）值。

1.3.4 CYFRA21-1，NSE及CEA浓度检测：使用全自动化学发光免疫分析仪完成各样本中CYFRA21-1，NSE及CEA的浓度检测，按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学分析 使用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，计量资料服从正态分布以均数±标准差（±s）表示，非正态分布以中位数（P25，P75）表示。两组间数据服从正态分布，差异比较采用t检验；非正态分布的两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用kruskal-wallisH检验，P＜0.05为差异有统计学意义。ROC曲线用于评估各项检测指标对肺癌的诊断效能。

2 结果

2.1 血浆miR-3151在两组中的表达 肺癌组及对照组血浆miR-3151（nmol/L）的表达量分别为：86.356（19.893，305.155），8.871（4.620，14.037）。与对照组相比，血浆miR-3151在肺癌组表达显著上调，差异有统计学意义（Z=-10.039，P＜0.001）。

2.2 肺癌患者血浆miR-3151表达与临床病理特征的关系 见表1。比较血浆miRNA-3151的表达水平，伴有淋巴结转移的患者高于无淋巴结转移患者，Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（Z=-2.336，-2.628，均P＜0.05）。血浆miR-3151的表达水平在患者性别、年龄、吸烟史、组织学类型、肿瘤大小和分化程度之间的差异无明显统计学意义（均P＞0.05）。

表1 肺癌患者血浆miR-3151表达与临床病理特征的关系[n=120,M(P25,P75)]

2.3 血浆miR-3151，CYFRA21-1，NSE及CEA对肺癌的诊断价值 见表2。单指标检测时，miR-3151，CYFR21-1，NSE及CEA用于肺癌诊断的的AUC（95%CI）分别为0.875（0.830～0.919），0.704（0.639～0.770），0.769（0.707～0.830）和0.632（0.562～0.702）。两项指标联合检测时，AUC值较单指标检测有进一步提升，特别是miR-3151联合NSE时AUC（95%CI）高达0.909（0.872～0.946），灵敏度89.2%，特异度71.7%，对肺癌的诊断效能最高。

表2 血浆miR-3151，CYFRA21-1，NSE及CEA对肺癌的诊断价值

3 讨论

肺癌的发生发展机制复杂，目前尚未完全阐明，miRNA的发现及其研究成果加深了我们对癌症发生发展机制的探索。超过50%的miRNA基因定位于与肿瘤相关的基因组区域[5]，通过下调癌基因或抑癌基因而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移[6-7]，因此miRNA的表达失调可能是肿瘤发生发展的重要机制之一。近年来，miRNA作为微创生物标志物已显示出良好的应用前景。据研究，miRNA稳定存在于血液样本中，不受RNase降解和样本多次冻融的影响[8]，检测外周血中miRNA的表达情况，对肿瘤的早期诊断和预后评估意义重大。冯磊等[9]研究发现，与宫颈上皮内瘤样病变患者和健康女性相比，血浆miR-10b在宫颈癌患者中表达上调，对宫颈癌早期诊断具有较高的诊断价值。黄刚等[10]研究认为，检测血浆miR-145和miR-221的表达有助于监测非小细胞肺癌术后复发。

目前国内外关于miR-3151的研究多集中在血液系统肿瘤中，而在实体瘤中的研究报道较少。有研究发现，在急性髓系白血病[11-13]、BRAF突变的恶性黑色素瘤和甲状腺乳头状癌[14]中，miR-3151充当促癌基因，通过下调抑癌基因TP53的表达，促进肿瘤进展，影响预后。在本研究中，我们利用磁珠技术高效分离miRNA，并采用高灵敏度、高特异度的TaqMan定量PCR方法检测肺癌患者和健康人血浆中miRNA-3151的表达。结果发现，血浆miRNA-3151在肺癌组中的表达显著高于对照组，在伴淋巴结转移及Ⅲ～Ⅳ期患者中的表达高于无淋巴结转移和Ⅰ～Ⅱ期患者，miRNA-3151的高表达提示肿瘤进展。我们的结果与之前的文献报道相似，提示miRNA-3151可能充当促癌基因参与肺癌的发生及进展。

寻找无创或微创并且具有较高灵敏度和特异度的肿瘤标志物,有助于肿瘤的早期诊断及预后预测,对于改善肿瘤病人的预后具有重要的临床意义。CYFRA21-1，NSE及CEA是目前临床上常用的肺癌诊断标志物，但是它们的灵敏度和特异度较低，在一定程度上使用受到限制。本研究进一步分析比较了血浆miR-3151，CYFRA21-1，NSE及CEA对肺癌的诊断能力，结果显示，单项指标检测时，血浆miR-3151对肺癌的诊断价值优于后三者；两项指标联合检测时，诊断效能较单项指标有进一步提升，特别是miR-3151联合NSE时，对肺癌的诊断效能最高，AUC为0.909，灵敏度89.2%，特异度71.7%，均高于任一单独指标。

综上所述，miR-3151在肺癌患者血浆中高表达，与患者的临床指标相关，可能参与肺癌的发生发展。血浆miR-3151是有前景的肺癌微创诊断标志物，与传统肿瘤标志物联合检测将进一步提高对肺癌诊断的准确度。在未来的研究中，我们将探索miR-3151在肺癌中的调控机制，以期为肺癌诊治提供新思路。